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引物合成的步驟及方法介紹

信息來源：金開瑞作者：genecreate 發(fā)布時間：2019-01-29 13:50:22

Oligo DNA的人工化學(xué)合成始于50年代初期，1980年，全自動的固相DNA合成儀面市后，使得快速、高效合成Oligo DNA成為可能，這大大地推動了生物工程技術(shù)的蓬勃發(fā)展。

現(xiàn)在一般都采用β-乙腈亞磷酰胺化學(xué)合成Oligo DNA，將DNA固定在固相載體上完成DNA鏈的合成的合成時從3' →5' 方向進行，通常3' 端的第一個堿基結(jié)合在Glass擔(dān)體 (Controlled Pore Glass，CPG)上。其具有高效、快速的偶聯(lián)以及起始反應(yīng)物比較穩(wěn)定的特點。

合成步驟

Step1：脫掉附加在CPG擔(dān)體上的第一個堿基5' -OH基團上的保護基 (DMTr)，準備附加下一個新的堿基；

Step2：活化新的堿基單體 (Phosphoramidite)，準備與第一個堿基進行反應(yīng)；

Step3：第二個堿基與第一個堿基發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)；

Step4：將沒有反應(yīng)的第一個堿基的5' -OH加帽封死 (Capping)，使其不再進一步參與反應(yīng)；

Step5：將核苷亞磷酸酯氧化成更穩(wěn)定的核苷磷酸酯 (即將三價磷氧化成五價磷)。

Step6：重復(fù)進行Step1～Step5的循環(huán)，直至合成完所需的Oligo DNA序列。

Step7:合成結(jié)束后，將Oligo DNA分子從CPG上切下，再進行進一步的純化。

圖1 Oligo DNA合成原理。N1代表第一個堿基，N2代表第二個堿基，依此類推。

OD數(shù)的確定

一般PCR擴增，2 OD引物，可以做200-500次50ul標準PCR反應(yīng)。如果是做基因拼接或退火后做連接，1 OD就足夠了。但是有些研究人員，就做幾次PCR，但是卻要5-10 OD。做全基因構(gòu)建的引物都比較長，但是我們有些研究人員也要求高OD數(shù)。片段越長, 最后全長得率就越低，出錯的幾率就越大。超出需要之外的OD數(shù)要求，也是一種浪費。

引物純度檢測

實驗室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝膠進行電泳。取0.2-0.5OD的引物，用尿素飽和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到飽和，上樣前加熱變性(95℃,2mins)。加入尿素的目的一是變性，二是增加樣品比重，容易加樣。600V電壓進行電泳，一定時間后(約2-3小時)，剝膠，用熒光TLC板在紫外燈下檢測帶型，在主帶之下沒有雜帶，說明純度是好的。如果條件許可，也可以用EB 染色或銀染方式染色。

引物級別選擇

應(yīng)用	引物長度要求	純度級別要求
一般PCR擴增	< 45 base	PAGE
診斷PCR擴增	< 40 base	OPC，PAGE
DNA測序	20 base左右	OPC
亞克隆，點突變等	根據(jù)實驗要求	OPC，PAGE，HPLC
基因構(gòu)建（全基因合成）	根據(jù)實驗要求	PAGE
反義核酸	根據(jù)實驗要求	PAGE
修飾引物	根據(jù)實驗要求	PAGE，HPLC