畢赤酵母表達系統目前已是僅次于大腸桿菌的最常用蛋白表達系統，廣泛應用于實驗室以及生產規模的蛋白質制備、表征以及結構解析等方面，已有上千種蛋白在畢赤酵母系統中得到成功地表達和純化。

        畢赤酵母表達系統具有易于高密度發酵，能使產物有效分泌并適當糖基化、培養方便經濟等特點，已基本成為非常完善的外源基因表達系統。在醫藥蛋白領域，已有胰島素、乙肝表面抗原、人血清蛋白、表皮生長因子等多種蛋白使用畢赤酵母表達并實現商品化制備。大量的實例已經證實畢赤酵母表達系統為高效、實用、簡便，可提高表達量并保持產物生物學活性為突出特征的外源基因表達系統，非常適宜于擴大為工業規模。

 

1.畢赤酵母表達系統表達胰島素

        糖尿病是一種由遺傳和環境因素相互作用而引起的臨床綜合癥，其基本病理特征為絕對或相對性胰島素分泌不足所引起的代謝紊亂。作為最重要的降血糖藥，胰島素對胰島素缺乏導致的各型糖尿病均有效，具有巨大的市場需求。因此開發生產胰島素的新途徑、優化現有生產胰島素的手段一直是醫藥生物化學領域的一個重要課題。

畢赤酵母是近年發展起來的蛋白表達體系，其醇氧化酶基因啟動子是誘導型強啟動子，可用來調控外源蛋白的表達。該系統具有操作技術簡單，可進行高水平的胞內或胞外表達，及對表達產物進行翻譯后修飾與加工等顯著優點。利用基因重組技術構建高效表達胰島素前體的甲醇畢赤酵母工程菌株，可發酵生產人胰島素。

 

2.乙型肝炎表面抗原

        乙型肝炎(Hepatitis B，HB)是由乙型肝炎病毒(Hepatitis B viurs，HBV)引起的世界范圍傳染性疾病，其囊膜蛋白乙肝表面抗原HBsAg，能夠誘導機體產生保護性抗體乙肝表面抗體HBsAb，是乙肝疫苗的主要成分。同時，HBsAg也是ELISA診斷免疫是否成功的主要試劑成分，大量制備HBsAg在預防和檢測乙型肝炎方面有重要意義。

HBsAg作為診斷HBV感染最重要也是最常用的標志物，“a”決定簇的基因區的突變導致其HBsAg不能被一些市售診斷試劑盒中的單克隆抗體或多克隆抗體識別，因此提高HBsAg試劑盒的臨床靈敏度和突變體的識別能力是必要的。目前HBsAg突變體的種類很多，其中以G145R最常見也最重要，也是主要研究對象。建立畢赤酵母表達系統，開展HBsAg和其突變體G145R的表達和純化，并對這兩種蛋白進行初步研究，可以為進一步完善HBsAg診斷試劑盒及其變異檢測的研制奠定一定的基礎。

 

3.腫瘤壞死因子

        研究表明，將人類腫瘤壞死因子相關凋亡配體(TRAIL)生物活性部分在巴斯德畢赤酵母中分泌表達發現發酵液中分子量約為19kD和38kD的蛋白質能被TRAIL多克隆抗體特異性識別，且具有在體外誘導腫瘤細胞凋亡的活性。通過薄層掃描分析顯示目的蛋白最高可占可溶性總蛋白的36%。通過實驗結果表明，在巴斯德畢赤酵母表達系統中表達的TRAIL能以寡聚體的形式存在并且具有生物學活性。

 

4.表皮生長因子 

        構建并篩選出重組人表皮生長因子(rhEGF)高表達的畢赤酵母基因工程菌株，于30L發酵罐進行中試發酵按1:15接種15 L FBSM發酵，pH 6.0、28～30 ℃、DO 20%～30%、流加甲醇誘導發酵42 h，rhEGF的表達量可達1g/L。采用疏水層析、離子交換柱層析及分子篩凝膠層析的方法分離純化rhEGF，獲得的rhEGF試制品的純度大于95%，得率在40%以上。通過基質輔助激光解吸電離/飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)測定rhEGF的分子質量與理論分子質量一致。N端蛋白序列分析儀分析其N端氨基酸序列，測序結果與理論的氨基酸序列一致。采用Balb/c 3T3細胞增殖/MTT比色法測定其活性，測定rhEGF的活性為1.0×106 IU/mg,與WHO標準品相當。該研究實現了畢赤酵母高效表達rhEGF并純化得到符合《中國藥典》標準的rhEGF,為工業化生產rhEGF提供基礎。

 

5、人血清蛋白

        人血清白蛋白是一種在醫學上應用廣泛，需求量大的蛋白質藥物。而目前血漿提取生產的方式難以滿足市場的要求，用基因工程方法生產人血清白蛋白無疑具有巨大的商業價值。由于巴斯德畢赤酵母表達系統自身的許多優點，使得其在表達外源蛋白中具有十分大的優勢。用巴斯德畢赤酵母構建并篩選分泌重組人血清白蛋白(rHSA)基因工程高產菌株，并對其發酵純化條件進行初步研究。免疫印跡檢測所表達的rHSA具有免疫原性。

 

6、抗體

        經分步整合法在巴氏畢赤酵母中表達人抗狂犬病毒全分子抗體。方法分別構建人重鏈和輕鏈抗體表達質粒，以分步整合法電轉化X33酵母菌，甲醇誘導表達后進行ELISA篩選及Western blot分析。結果SDS-PAGE、Western blot檢測均在分子量約55kD及25kD處出現特異性條帶，ELISA檢測顯示所獲全分子抗體具有良好的狂犬病毒抗原結合活性，表達量約8～10mg/L。結論在畢赤酵母菌中可經甲醇誘導產生具狂犬病毒抗原結合活性的分泌型人全分子抗體。

 

畢赤酵母表達系統的應用前景

（1）表達具有生物活性的功能蛋白

作為一種逐漸成熟的表達異源蛋白的系統，畢赤酵母具有真核生物的翻譯后加工修飾的特點是能夠得到廣泛應用的最大魅力所在。

 

（2）表達醫用產品

利用畢赤酵母系統可以生產醫用高效蛋白質，如用畢赤酵母生產的重組蛋白有牛胰蛋白酶原、人2A型蛋白磷酸酯酶(PP2A)亞基、乙型肝炎病毒前S1蛋白、戊型肝炎病毒開讀框架2片斷、人白介素-2、腫瘤壞死因子。另外腫瘤細胞的一個關鍵的蛋白酶MT1-MMP，在刪去C末端跨膜區后，轉化酵母并獲得表達，這對于癌癥的治療有重要的意義。

 

（3）畢赤酵母可作為研究一些重要理論和科研的有力工具

畢赤酵母的表達產物可用于結構的研究用畢赤酵母表達系統表達了15N標記的大麥非特異性脂轉移蛋白2型(ns-LTP2)，在嚴格控制生理、生化條件及連接條件的情況下，獲得的ns-LTP2蛋白可用于進行精細結構的研究。

隨著酵母遺傳學及生物學研究的進一步深入，人們越來越多地應用畢赤酵母作為外源基因的表達系統。其在功能蛋白的生產上、商業產品的開發和科學研究上將發揮越來越重要的作用。

 

注明：轉自千純生物微信公眾號。