金開瑞自主研究發表Paper：SWATH-MS定量蛋白質組解密miR-26a在人類癌癥中的功能
信息來源：金開瑞 作者：genecreate 發布時間：2019-03-20 16:12:29
題目：Label-free Quantitative Analysis of Protein Expression Alterations in miR-26a-Knockout HeLa Cells using SWATH-MS Technology
期刊：Scientific Reports
影響因子：4.122
主要技術：SWATH-MS
研究背景
微小RNA（miRNA）能夠以序列特異性方式結合靶mRNA的3'非翻譯區，隨后抑制基因翻譯。人類miR-26a在基因水平上的研究較多，且其眾多功能已揭示，但是靶基因的蛋白質水平方面的研究尚屬空白。
研究內容及結果
1. 使用CRISPR-Cas9基因編輯系統構建miR-26a敲除的HeLa細胞系
作者使用CRISPR-Cas9基因編輯系統構建了miR-26a敲除的HeLa細胞系。作者首先設計了兩條single-guide RNAs (sgRNAs)耗盡miR-26a（圖1a），并克隆到lentiCRISPRv2載體中，通過DNA測序確認插入載體（圖1b）。轉染后，通過核苷酸測序也證實了由靶位點中的28-bp缺失引起的突變（圖1c）。敲除株系中的miR-26a水平顯著低于（降低76％）野生型細胞中的miR-26a水平。
期刊：Scientific Reports
影響因子：4.122
主要技術：SWATH-MS
研究背景
微小RNA（miRNA）能夠以序列特異性方式結合靶mRNA的3'非翻譯區，隨后抑制基因翻譯。人類miR-26a在基因水平上的研究較多，且其眾多功能已揭示，但是靶基因的蛋白質水平方面的研究尚屬空白。
研究內容及結果
1. 使用CRISPR-Cas9基因編輯系統構建miR-26a敲除的HeLa細胞系
作者使用CRISPR-Cas9基因編輯系統構建了miR-26a敲除的HeLa細胞系。作者首先設計了兩條single-guide RNAs (sgRNAs)耗盡miR-26a（圖1a），并克隆到lentiCRISPRv2載體中，通過DNA測序確認插入載體（圖1b）。轉染后，通過核苷酸測序也證實了由靶位點中的28-bp缺失引起的突變（圖1c）。敲除株系中的miR-26a水平顯著低于（降低76％）野生型細胞中的miR-26a水平。
圖1 CRISPR-Cas9系統在HeLa細胞中產生miR-26a敲除系
2. miR-26a缺陷細胞表現出明顯的細胞生長和增殖
作者發現，與野生型HeLa細胞相比，miR-26a缺陷細胞（敲除株系）表現出明顯的細胞生長現象（圖2a）。因此，作者又比較了野生型和敲除株系的細胞增殖情況，發現在miR-26a缺陷細胞中觀察到更高百分比的細胞停留在G2期（圖2b）。Annexin V染色法和流式細胞術確定凋亡程度，發現miR-26a缺陷系中凋亡細胞的百分比顯著低于野生型HeLa細胞（圖2c）。這些數據表明miR-26a調控細胞生長和增殖的功能，這和已有的報道結果一致。
作者發現，與野生型HeLa細胞相比，miR-26a缺陷細胞（敲除株系）表現出明顯的細胞生長現象（圖2a）。因此，作者又比較了野生型和敲除株系的細胞增殖情況，發現在miR-26a缺陷細胞中觀察到更高百分比的細胞停留在G2期（圖2b）。Annexin V染色法和流式細胞術確定凋亡程度，發現miR-26a缺陷系中凋亡細胞的百分比顯著低于野生型HeLa細胞（圖2c）。這些數據表明miR-26a調控細胞生長和增殖的功能，這和已有的報道結果一致。
圖2 miR-26a缺陷細胞表現出改變的生長速率和細胞周期
3. SWATH-MS相對定量蛋白質組學
作者選擇正常HeLa細胞（NC-Hela）和miR-26a敲除細胞（KO-HeLa），三個生物學重復，進行SWATH-MS定量蛋白質組學的實驗。共鑒定到3201種蛋白質，其中差異表達蛋白有466種（p <0.05，foldchange> 1.5），上調蛋白214種，下調蛋白252種（圖3a，b）。功能注釋發現這些差異蛋白發揮應激反應、增殖、定位、發育、信號傳導等方面的功能（圖3c，d）。與野生型細胞相比，HSP90在miR-26a敲除系中表達增加76.4％。據報道，HSPs在多種人類癌癥中表達上調，其高水平表達可能為癌癥發展提供有力環境。下調蛋白如核糖體蛋白（RP）是核糖體組分，其在核糖體生物發生和蛋白質翻譯中起作用。有研究指出有幾種RP是斑馬魚的癌癥基因，此外，在一系列的癌癥類型個體中發現RP表達一致失調。這合理地解釋了作者在miR-26a缺陷系中某些RP的下調，并顯示出腫瘤特征。總而言之，作者的蛋白質組學分析構建了HeLa細胞中miR-26a調節的轉錄物清單，并為進一步探索miR-26a在人類癌癥中的功能提供了基礎。
作者選擇正常HeLa細胞（NC-Hela）和miR-26a敲除細胞（KO-HeLa），三個生物學重復，進行SWATH-MS定量蛋白質組學的實驗。共鑒定到3201種蛋白質，其中差異表達蛋白有466種（p <0.05，foldchange> 1.5），上調蛋白214種，下調蛋白252種（圖3a，b）。功能注釋發現這些差異蛋白發揮應激反應、增殖、定位、發育、信號傳導等方面的功能（圖3c，d）。與野生型細胞相比，HSP90在miR-26a敲除系中表達增加76.4％。據報道，HSPs在多種人類癌癥中表達上調，其高水平表達可能為癌癥發展提供有力環境。下調蛋白如核糖體蛋白（RP）是核糖體組分，其在核糖體生物發生和蛋白質翻譯中起作用。有研究指出有幾種RP是斑馬魚的癌癥基因，此外，在一系列的癌癥類型個體中發現RP表達一致失調。這合理地解釋了作者在miR-26a缺陷系中某些RP的下調，并顯示出腫瘤特征。總而言之，作者的蛋白質組學分析構建了HeLa細胞中miR-26a調節的轉錄物清單，并為進一步探索miR-26a在人類癌癥中的功能提供了基礎。
圖3 差異蛋白分析
4. miR-26靶向蛋白互作分析
接下來，作者對表達水平顯著改變的蛋白質進行了PPI分析（圖4），發現在413種蛋白質中鑒定出1950種相互作用。其中DNA拓撲異構酶2-α（TOP2A）顯示與63種其他蛋白質的相互作用，代表了相互作用網絡中最杰出的蛋白質節點。已有報道指出TOP2A存在于乳腺癌和其他一些癌癥中，并與P53存在相互作用，而P53是一種重要的腫瘤抑制因子。TOP2A和其他miR-26a調節的蛋白質的多重相互作用表明TOP2A相關途徑在癌發生或抗癌作用中起關鍵作用。
接下來，作者對表達水平顯著改變的蛋白質進行了PPI分析（圖4），發現在413種蛋白質中鑒定出1950種相互作用。其中DNA拓撲異構酶2-α（TOP2A）顯示與63種其他蛋白質的相互作用，代表了相互作用網絡中最杰出的蛋白質節點。已有報道指出TOP2A存在于乳腺癌和其他一些癌癥中，并與P53存在相互作用，而P53是一種重要的腫瘤抑制因子。TOP2A和其他miR-26a調節的蛋白質的多重相互作用表明TOP2A相關途徑在癌發生或抗癌作用中起關鍵作用。
圖4 差異蛋白PPI分析
5. 候選蛋白驗證
結合miR-26a敲除株系表現出細胞生長和增殖改變的觀察結果，作者選擇了幾種參與細胞增殖的蛋白質，并通過蛋白質印跡和PRM驗證定量結果。結果表明驗證蛋白質均顯示出一致的表達趨勢，如現CDK1、CDK4和CDK6在miR-26a敲除株系中上調，表明它們被miR-26a抑制。CDK1是促進有絲分裂的中樞調節因子，CDK4和CDK6在早期G1期被激活。細胞色素c（CYC）和細胞凋亡調節因子BAX在miR-26a敲除系中被下調，表明它們被miR-26a激活。這些蛋白質在三種實驗方法，即SWATH-MS、PRM和WB中顯示出相同的表達水平改變趨勢，表明SWATH-MS實驗定量結果的可靠性。
結合miR-26a敲除株系表現出細胞生長和增殖改變的觀察結果，作者選擇了幾種參與細胞增殖的蛋白質，并通過蛋白質印跡和PRM驗證定量結果。結果表明驗證蛋白質均顯示出一致的表達趨勢，如現CDK1、CDK4和CDK6在miR-26a敲除株系中上調，表明它們被miR-26a抑制。CDK1是促進有絲分裂的中樞調節因子，CDK4和CDK6在早期G1期被激活。細胞色素c（CYC）和細胞凋亡調節因子BAX在miR-26a敲除系中被下調，表明它們被miR-26a激活。這些蛋白質在三種實驗方法，即SWATH-MS、PRM和WB中顯示出相同的表達水平改變趨勢，表明SWATH-MS實驗定量結果的可靠性。
圖5 候選蛋白驗證分析
6. 候選靶標序列分析
為了從SWATH蛋白質組學鑒定的候選靶標轉錄物中發現miR-26a匹配序列，作者對蛋白質組學鑒定的所有基因的轉錄物進行核苷酸序列檢所分析，以獲得它們的3'-UTR序列。作者使用PicTar、TargetScan、miRanda和RNA22來預測miR-26a的潛在靶標，然后將其與蛋白質組數據進行比較（圖6a）。圖6a列出基于蛋白質組學分析在敲除細胞系中高表達且通過上述三種生物信息學預測方法成功預測的miR-26a靶基因。
為了從SWATH蛋白質組學鑒定的候選靶標轉錄物中發現miR-26a匹配序列，作者對蛋白質組學鑒定的所有基因的轉錄物進行核苷酸序列檢所分析，以獲得它們的3'-UTR序列。作者使用PicTar、TargetScan、miRanda和RNA22來預測miR-26a的潛在靶標，然后將其與蛋白質組數據進行比較（圖6a）。圖6a列出基于蛋白質組學分析在敲除細胞系中高表達且通過上述三種生物信息學預測方法成功預測的miR-26a靶基因。
圖6候選靶標序列分析
7. 螢光素酶實驗驗證miR-26a靶標
作者隨后進行了螢光素酶實驗以確定miR-26a是否直接調節從SWATH分析中鑒定的候選靶標。作者實驗了在3'-UTR區域中的二十四個候選靶標（圖6a），其中6個候選靶標即NUF2、CDK6、MYPN、DNAJC9、USP47和PPA1的螢光素酶實驗顯示出顯著降低（p <0.05）（圖6b），這六個靶標包含與miR-26a匹配的3'UTR中的種子序列（圖7a）。另外，WB結果表明，這些靶標的表達水平在miR-26a過表達體系中下調（圖7b）。
作者隨后進行了螢光素酶實驗以確定miR-26a是否直接調節從SWATH分析中鑒定的候選靶標。作者實驗了在3'-UTR區域中的二十四個候選靶標（圖6a），其中6個候選靶標即NUF2、CDK6、MYPN、DNAJC9、USP47和PPA1的螢光素酶實驗顯示出顯著降低（p <0.05）（圖6b），這六個靶標包含與miR-26a匹配的3'UTR中的種子序列（圖7a）。另外，WB結果表明，這些靶標的表達水平在miR-26a過表達體系中下調（圖7b）。
圖7 驗證miR-26a與六種潛在靶標之間相互作用
文章小結
作者基于SWATH的蛋白質組學揭示了潛在的miR-26a靶標，并進一步采用生物信息學方法和螢光素酶實驗驗證miR-26a與潛在靶標之間的相互作用，且這些潛在靶標在miR-26a過表達株系中表達抑制，表明它們是miR-26a的真正靶標。總之，這項研究首次通過大規模蛋白質組學方法在HeLa細胞中創建了miR-26a靶基因的清單。此外，該研究的發現為進一步探索miR-26a在人類癌癥中的功能奠定了一定的基礎。
解析文獻
Hexiao Shen, Li Li, et al. Label-free Quantitative Analysis of Protein Expression Alterations in miR-26a-Knockout HeLa Cells using SWATH-MS Technology[J]. Scientific Reports, 2019, 9(1):1399
作者基于SWATH的蛋白質組學揭示了潛在的miR-26a靶標，并進一步采用生物信息學方法和螢光素酶實驗驗證miR-26a與潛在靶標之間的相互作用，且這些潛在靶標在miR-26a過表達株系中表達抑制，表明它們是miR-26a的真正靶標。總之，這項研究首次通過大規模蛋白質組學方法在HeLa細胞中創建了miR-26a靶基因的清單。此外，該研究的發現為進一步探索miR-26a在人類癌癥中的功能奠定了一定的基礎。
解析文獻
Hexiao Shen, Li Li, et al. Label-free Quantitative Analysis of Protein Expression Alterations in miR-26a-Knockout HeLa Cells using SWATH-MS Technology[J]. Scientific Reports, 2019, 9(1):1399
最新動態
-
09.23
中藥的現代詮釋：外泌體如何革新傳統醫學？
-
07.02
1+1＞2！深度解析RNA測序數據挖掘邏輯和后期實驗設計思路，輕松研獲10+ SCI
-
07.01
“稻”亦有道——盤點近期水稻研究的重大突破
-
06.28
科學與美學的結合體：植物亞細胞定位技術詳解
-
06.28
“聚焦新質生產力，激發科研新動能”|LCA躋身蛋白互作研究的新銳力量
-
06.05
知無不“研”|一文讀懂免疫共沉淀技術（Co-IP）
-
05.14
四大研究利器(Co-IP、BIFC、Y2H、GST pull-down)助力速配蛋白互作“最佳拍檔”
-
05.14
高效、精準、直觀、實時——取經“蛋白互作研究翹楚”BIFC！
-
05.14
轉染效率低、干擾效果差、重復性欠佳...siRNA研究頻遇“攔路虎”怎么辦？
-
04.22
一文讀懂EMSA技術核心要點，讓“emsa” 秒變“easy”
X 
