RNA FISH揭示植物細胞中單個RNA轉錄物的變化
信息來源：金開瑞 作者：genecreate 發布時間：2019-03-28 14:58:26
題目：Mutually exclusive sense-antisense transcription at FLC facilitates environmentally induced gene repression
期刊：Nature Communications
影響因子：12.353
主要技術：RNA FISH
研究背景
在探究非編碼RNA的調控機制中，有相當多的研究者對反義轉錄感興趣，反義RNA可通過堿基配對與mRNA互補并最終抑制mRNA翻譯。例如，反義RNA在環境脅迫下調控擬南芥的春化過程，其中開花基因位點FLOWERING LOCUS C（FLC）在寒冷誘導后出現表觀遺傳沉默。春化早期階段的一組反義轉錄物（COOLAIR）包含著FLC基因座位點，但兩者的關聯機制尚不清楚。在持續的寒冷暴露下，選擇透明度高的擬南芥根部結構作為理想組織，采用單細胞RNA FISH方法來可視化和定量植物細胞中單個RNA轉錄物的變化。
研究內容及結果
1. 單細胞RNA FISH用于細胞分析
作者采用單細胞RNA FISH來可視化和定量植物細胞中的單個RNA轉錄物水平，選取透明的發育良好的擬南芥根部做實驗組織。隨著寒冷暴露時間的延長，FLC信使RNA（mRNA）轉錄物在每個細胞中顯示出逐級減少（圖1a-1c）。在六周的寒冷暴露后組成性基因蛋白磷酸酶2A（PP2A）的表達水平依然很高，這與FLC-mRNA的RT-RCR測量結果一致。與此同時，在兩周的寒冷暴露后，FLC非剪接轉錄迅速減少且許多細胞顯示沒有熒光信號（圖1a，1b和1d）。對比寒冷暴露前后，實驗結果中沒有明顯地發現mRNA重新定位和mRNA信號分布的變化。由此看出，在寒冷的環境中，擬南芥根部迅速在基因座上關閉FLC轉錄的動態變化。
期刊：Nature Communications
影響因子：12.353
主要技術：RNA FISH
研究背景
在探究非編碼RNA的調控機制中，有相當多的研究者對反義轉錄感興趣，反義RNA可通過堿基配對與mRNA互補并最終抑制mRNA翻譯。例如，反義RNA在環境脅迫下調控擬南芥的春化過程，其中開花基因位點FLOWERING LOCUS C（FLC）在寒冷誘導后出現表觀遺傳沉默。春化早期階段的一組反義轉錄物（COOLAIR）包含著FLC基因座位點，但兩者的關聯機制尚不清楚。在持續的寒冷暴露下，選擇透明度高的擬南芥根部結構作為理想組織，采用單細胞RNA FISH方法來可視化和定量植物細胞中單個RNA轉錄物的變化。
研究內容及結果
1. 單細胞RNA FISH用于細胞分析
作者采用單細胞RNA FISH來可視化和定量植物細胞中的單個RNA轉錄物水平，選取透明的發育良好的擬南芥根部做實驗組織。隨著寒冷暴露時間的延長，FLC信使RNA（mRNA）轉錄物在每個細胞中顯示出逐級減少（圖1a-1c）。在六周的寒冷暴露后組成性基因蛋白磷酸酶2A（PP2A）的表達水平依然很高，這與FLC-mRNA的RT-RCR測量結果一致。與此同時，在兩周的寒冷暴露后，FLC非剪接轉錄迅速減少且許多細胞顯示沒有熒光信號（圖1a，1b和1d）。對比寒冷暴露前后，實驗結果中沒有明顯地發現mRNA重新定位和mRNA信號分布的變化。由此看出，在寒冷的環境中，擬南芥根部迅速在基因座上關閉FLC轉錄的動態變化。
圖1 單細胞定量春化過程中mRNA表達和FLC轉錄水平
2. 寒冷暴露后COOLAIR聚集在FLC附近
在溫暖生長條件下，僅約有30%的植物細胞檢測到非剪接轉錄物的內含子探針（圖2a-2b），揭示了在寒冷暴露初期低表達水平的COOLAIR被激活。經過兩周的寒冷暴露后，在超過約30%根部總細胞數的各類型細胞中，均檢測到大量的non-spliced COOLAIR和COOLAIR（圖2b-2c）。在寒冷暴露的根細胞中進行連續RNA-DNA FISH檢測，范圍大的COOLAIR熒光焦點中心與FLC DNA FISH熒光信號共定位（圖2d），單細胞RNA FISH和補充實驗也同樣說明了COOLAIR像“云”一樣聚集在FLC出現的場所（圖2e）。正如圖2f所示，作者在COOLAIR最大內含子區域的5’或3’末端設計特定探針，在兩周的寒冷暴露后，在一些細胞核心區域中5’端探針組發出更高的信號，而在另一些細胞核中5’端探針組和3’端探針組均顯示出同等類似的強信號（圖2g-2h），由此推測“云”結構可能是由基因座轉錄的逐漸累積形成的。
在溫暖生長條件下，僅約有30%的植物細胞檢測到非剪接轉錄物的內含子探針（圖2a-2b），揭示了在寒冷暴露初期低表達水平的COOLAIR被激活。經過兩周的寒冷暴露后，在超過約30%根部總細胞數的各類型細胞中，均檢測到大量的non-spliced COOLAIR和COOLAIR（圖2b-2c）。在寒冷暴露的根細胞中進行連續RNA-DNA FISH檢測，范圍大的COOLAIR熒光焦點中心與FLC DNA FISH熒光信號共定位（圖2d），單細胞RNA FISH和補充實驗也同樣說明了COOLAIR像“云”一樣聚集在FLC出現的場所（圖2e）。正如圖2f所示，作者在COOLAIR最大內含子區域的5’或3’末端設計特定探針，在兩周的寒冷暴露后，在一些細胞核心區域中5’端探針組發出更高的信號，而在另一些細胞核中5’端探針組和3’端探針組均顯示出同等類似的強信號（圖2g-2h），由此推測“云”結構可能是由基因座轉錄的逐漸累積形成的。
圖2 寒冷暴露后在一些細胞中COOLAIR轉錄迅速增加并覆蓋位點
3. COOLAIR轉錄和FLC轉錄在基因座水平上呈現反相關
在寒冷暴露下，作者通過單分子RNA FISH顯像技術分析“云”結構對FLC轉錄的影響機制。正如圖3a所示，在植物正常暴露或寒冷暴露下，COOLAIR轉錄（綠色）和FLC（紅色）轉錄顯示相互排斥的關系，在單個基因座上正義轉錄和反義轉錄也呈現反相關，結果表明基因座上的轉錄在任何給定時間下都是單向的（圖3b）。盡管FLC正義轉錄和反義轉錄可能在單個細胞中共存，但也總是在給定時間內從不同等位基因上轉錄而來（圖3c）。另外有報道指出，COOLAIR停留在FLC轉錄位點并以順式方式調節FLC轉錄，佐證了寒冷暴露下大多數基因座誘導COOLAIR轉錄和關閉FLC轉錄。
在寒冷暴露下，作者通過單分子RNA FISH顯像技術分析“云”結構對FLC轉錄的影響機制。正如圖3a所示，在植物正常暴露或寒冷暴露下，COOLAIR轉錄（綠色）和FLC（紅色）轉錄顯示相互排斥的關系，在單個基因座上正義轉錄和反義轉錄也呈現反相關，結果表明基因座上的轉錄在任何給定時間下都是單向的（圖3b）。盡管FLC正義轉錄和反義轉錄可能在單個細胞中共存，但也總是在給定時間內從不同等位基因上轉錄而來（圖3c）。另外有報道指出，COOLAIR停留在FLC轉錄位點并以順式方式調節FLC轉錄，佐證了寒冷暴露下大多數基因座誘導COOLAIR轉錄和關閉FLC轉錄。
圖3 COOLAIR轉錄和FLC轉錄在基因座水平上呈現反相關
4. COOLAIR促進關閉FLC轉錄表達
為驗證上述的結論，作者采用血管前體細胞開展COOLAIR表達驗證實驗，并探究FLC抑制程度是否取決于COOLAIR的存在（圖4a）。經過兩周的寒冷暴露后，根組織中FLC轉錄在約20%無COOLAIR表達細胞中（圖4c）和約75%COOLAIR表達細胞中（圖4b）下調。與此同時，作者分析得知寒冷誘導后COOLAIR引起在FLC-TEX缺陷表達的線性區域上FLC轉錄下調（圖4d），FLC正義轉錄在FLC-TEX缺陷表達的線性區域上較小幅度的下調（圖4d）。重要的是，這種拮抗效應只在COOLAIR表達細胞中發現，而在非COOLAIR表達細胞中沒有觀察到FLC抑制。以上數據說明，植物在寒冷暴露時COOLAIR的累積加速了FLC抑制效應。
為驗證上述的結論，作者采用血管前體細胞開展COOLAIR表達驗證實驗，并探究FLC抑制程度是否取決于COOLAIR的存在（圖4a）。經過兩周的寒冷暴露后，根組織中FLC轉錄在約20%無COOLAIR表達細胞中（圖4c）和約75%COOLAIR表達細胞中（圖4b）下調。與此同時，作者分析得知寒冷誘導后COOLAIR引起在FLC-TEX缺陷表達的線性區域上FLC轉錄下調（圖4d），FLC正義轉錄在FLC-TEX缺陷表達的線性區域上較小幅度的下調（圖4d）。重要的是，這種拮抗效應只在COOLAIR表達細胞中發現，而在非COOLAIR表達細胞中沒有觀察到FLC抑制。以上數據說明，植物在寒冷暴露時COOLAIR的累積加速了FLC抑制效應。
圖4 COOLAIR促進關閉FLC轉錄表達
文章小結
本文旨在探討在寒冷暴露下擬南芥中反義轉錄物（COOLAIR）和開花基因座C（FLC）在表觀遺傳沉默中的相互作用，FLC作為一種向生殖過渡的調節因子。本文作者采用單分子RNA FISH來處理和跟蹤細胞水平上COOLAIR和FLC的轉錄關系，發現正義轉錄和反義轉錄物雖然在同一細胞中可同時出現但在單個基因座上相互排斥。寒冷條件強烈地刺激大多數細胞中 COOLAIR轉錄上調，并且通過相互排斥的關系促進了順式細胞中的FLC轉錄關閉。COOLAIR轉錄后在每個位點形成密集的云結構，并通過改變H3K36Me3動力學作用影響FLC轉錄。綜上所述，反義轉錄的拮抗效應可能是許多表觀遺傳進化的核心機制，本文研究對豐富反義轉錄和植物表觀遺傳相關聯的的調控機制具有深遠的意義。
解析文獻
Rosa S., Duncan S., Dean C. Mutually exclusive sense-antisense transcription at FLC facilitates environmentally induced gene repression[J]. Nature Communications, 2016, 7: 13031.
本文旨在探討在寒冷暴露下擬南芥中反義轉錄物（COOLAIR）和開花基因座C（FLC）在表觀遺傳沉默中的相互作用，FLC作為一種向生殖過渡的調節因子。本文作者采用單分子RNA FISH來處理和跟蹤細胞水平上COOLAIR和FLC的轉錄關系，發現正義轉錄和反義轉錄物雖然在同一細胞中可同時出現但在單個基因座上相互排斥。寒冷條件強烈地刺激大多數細胞中 COOLAIR轉錄上調，并且通過相互排斥的關系促進了順式細胞中的FLC轉錄關閉。COOLAIR轉錄后在每個位點形成密集的云結構，并通過改變H3K36Me3動力學作用影響FLC轉錄。綜上所述，反義轉錄的拮抗效應可能是許多表觀遺傳進化的核心機制，本文研究對豐富反義轉錄和植物表觀遺傳相關聯的的調控機制具有深遠的意義。
解析文獻
Rosa S., Duncan S., Dean C. Mutually exclusive sense-antisense transcription at FLC facilitates environmentally induced gene repression[J]. Nature Communications, 2016, 7: 13031.
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