首頁集團概況技術專題

Cell重磅揭示前列腺癌中circRNA新的調(diào)控機制

信息來源：金開瑞作者：genecreate 發(fā)布時間：2019-04-18 15:57:09

題目：Widespread and functional RNA circularization in localized prostate cancer

期刊：Cell

影響因子：31.2

主要技術：circRNA-Seq / circRNA pull-down

研究背景

前列腺癌是全世界男性最常見的惡性腫瘤之一，一旦腫瘤遷移到腺體外就不可避免地會出現(xiàn)無法治愈的轉(zhuǎn)移性疾病。因此，在臨床上研究局部可治愈的前列腺腫瘤的生物學特性是非常有必要的。

circRNA是一個穩(wěn)定的共價閉合環(huán)，可躲避poly-A的捕獲，具有創(chuàng)造生物標志物的潛力。雖然已經(jīng)有研究者挖掘癌癥基因組圖譜網(wǎng)絡和評估組學信息，但是前列腺癌轉(zhuǎn)錄組的完全多樣性及其意義仍然是未知的。

本文作者選取了臨床144例局限性前列腺腫瘤樣本進行超深度RNA測序，共識別了1233個獨特的融合基因和76311個不同的circRNAs，并確定了171個對前列腺癌細胞增殖至關重要的circRNAs。由此可見，本次轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中包含許多傳統(tǒng)分子策略無法觀察到的功能實體，為將來RNA轉(zhuǎn)錄組研究提供了豐富的資源。

研究內(nèi)容及結(jié)果

1. 局限性前列腺癌的轉(zhuǎn)錄組分析

本文對144例前列腺腫瘤樣本進行轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)在所有腫瘤中有18340個轉(zhuǎn)錄本（圖1A-1B，其中包含15112個蛋白質(zhì)編碼亞型）。結(jié)合癌癥基因組圖譜網(wǎng)絡，按四分位間距排列前25% RNA并進行聚類分析，發(fā)現(xiàn)4585個轉(zhuǎn)錄本中包含3905個編碼RNA和680個非編碼RNA（圖1C），并描述了5個患者亞型（P1-P5）和5個RNA亞型（R1-R5）。

為確定候選腫瘤特異性亞型，從而評估融合基因的結(jié)構以及與侵襲性局部疾病的關系，發(fā)現(xiàn)有21例復發(fā)率超出預期的復發(fā)性融合（圖1D），并在超過10% SU2C轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)錄本中發(fā)現(xiàn)復發(fā)融合（圖1E，有17個高豐度的融合物，有12個在轉(zhuǎn)移病灶中復發(fā)）。結(jié)果揭示融合基因的轉(zhuǎn)變可能預示著對治療效果、轉(zhuǎn)移部位和疾病進展的選擇性適應。

圖1 局限性前列腺癌的轉(zhuǎn)錄組學特征

2. 局限性前列腺癌的circRNA表達譜

作者針對前列腺癌患者的腫瘤和細胞系展開序列分析和聯(lián)合治療，確定了34286個circRNAs，其中有33806個在RNase R處理后至少增加了1.5倍（圖2A）。將重疊區(qū)域中高信度的25036個circRNAs與circBase注釋進行比較，發(fā)現(xiàn)11例細胞或組織源中僅有1例檢測到67%的circRNAs（圖2B-2C）。

在基因水平上檢測每個樣本的親本線性、全線性和環(huán)狀的分子分數(shù)，其親本線性形式的高值表明了幾乎所有腫瘤的基因都有產(chǎn)生circRNA的傾向（圖2D）。采用STAR方法評估每個基因的八個特征并量化其環(huán)化的能力，結(jié)合ROC曲線來預測RNA環(huán)化事件并分析與豐度的相關性，結(jié)果表明circRNA環(huán)化產(chǎn)生所需的一些信息被嵌入到基因組中。高豐度circRNA往往具有高豐度線性親本RNA對應物（圖2E-2F），統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)有127個circRNA的豐度顯著地高于線性對應結(jié)構（圖2H）。

圖2 前列腺癌中circRNAs的鑒定與表征

3. circRNA豐度定義臨床上不同的腫瘤亞型

將144例腫瘤患者樣本分成四組份，采用circRNA-Z評分來量化特定的腫瘤亞型（圖3A）。通過比較CPC-GENE和NGS-ProToCol隊列發(fā)現(xiàn)，在預后水平上極端（Q1/Q4）患者組的circRNA分布情況明顯弱于穩(wěn)定（Q2/Q3）患者組（圖3B- 3C），且伴隨著較高的轉(zhuǎn)移發(fā)生率（圖3D）。通過比對CPC基因數(shù)據(jù)集中轉(zhuǎn)錄豐度與BCR注釋關系（圖3E），發(fā)現(xiàn)總circRNA和特異circRNA豐度均與臨床結(jié)果相關，重點提示了circRNA并非是轉(zhuǎn)錄噪音而是可能具有特定的致癌功能。

圖3 circRNA失調(diào)與前列腺癌進展有關

4. 功能篩選識別關鍵的circRNA

如圖4A中shRNA定位策略示意圖所示，通過后剪切位點設計shRNAs來篩查circRNA的特異性功能，由此針對1507個circRNA和1075個線性轉(zhuǎn)錄物均至少配有2個shRNAs（圖4B）。采用MaGeCK來鑒定耗盡的線性轉(zhuǎn)錄物和提高篩選有效性，發(fā)現(xiàn)在V16A細胞系中陽性對照組明顯高于陰性對照組，歸一化后shRNA豐度變化與時間點呈現(xiàn)高度相關（圖4C-4D）。由此逐步確定，在一個細胞系中總共至少有171個關鍵的circRNAs，其中91.8% circRNAs是必需的而其線性對應物是非必需的（圖4E-4F）。同時在四個細胞系中對10個關鍵的circRNAs進行敲除（KD）和過表達（OE）后測定細胞增殖情況，并結(jié)合LNCaP CRISPR數(shù)據(jù)庫篩查（圖4G-4H），發(fā)現(xiàn)circRNA驅(qū)動細胞增殖的過程獨立于其線性對應物。

圖4 shRNA篩選和關鍵circRNAs的驗證

5. 關鍵circRNAs的功能表征

在10個關鍵的circRNAs中，circCSNK1G3總長度為536 bp且包含了三個外顯子，在CPC基因隊列中發(fā)現(xiàn)其與線性對應物的豐度相似（環(huán)狀：線性 = 0.79，圖5A和5B）。通過對circCSNK1G3-OE/-KD處理的PC-3細胞進行RNA序列分析，發(fā)現(xiàn)許多基因在OE樣本和KD樣本呈現(xiàn)反向變化趨勢，并統(tǒng)計出279個激活基因和196個抑制基因（圖5C），同時觀察到在circCSNK1G3- KD樣本中有環(huán)狀和線性亞型共享的6個靶基因（圖5D）。在測序報告注釋后發(fā)現(xiàn)circCSNK1G3激活基因與細胞周期相關且促進細胞增殖，而CSNK1G3激活的關鍵是對酸性化學物質(zhì)的反應（圖5E-5F），這些數(shù)據(jù)均表明circCSNK1G3可促進前列腺癌細胞的增殖但不依賴于其線性轉(zhuǎn)錄本。

圖5 circCSNK1G3的基礎功能表征

6. circCSNK1G3與miR-181b/d互作促進前列腺癌細胞增殖

結(jié)合銀酸交聯(lián)和免疫沉淀測序（AGO-CLIP-Seq）數(shù)據(jù)進行分析預測，作者篩選出與circCSNK1G3互作的10個候選miRNAs。通過對CPC基因隊列亞群（n=119）中miRNA數(shù)據(jù)集分析，發(fā)現(xiàn)有5個miRNA（miR-181a/b/c/d 和 miR-196b）與circCSNK1G3表達顯著相關（圖6A），并預測出高度飽和的AGO結(jié)合位點在外顯子2區(qū)域（圖6B）。接著通過生物素標記circCSNK1G3進行RNA pull-down實驗，觀察到只有miR-181b/d顯著地富集（圖6C），且miR-181b/d反向驗證實驗也證實了這一點（圖6D）。在miR-181b/d-OE的PC-3細胞中發(fā)現(xiàn)細胞增殖和CBX7豐度顯著地下調(diào)，在circCSNK1G3-KD驗證實驗中發(fā)現(xiàn)mir-181b/d顯著地下調(diào)和cbx7顯著地上調(diào)，推測出CBX7作為前列腺癌中miR-181b特征靶點和腫瘤抑制因子（圖6E-6F）。與此同時，發(fā)現(xiàn)細胞周期基因（如CDK1和CDC25A）在miR-181b/d-OE細胞中上調(diào)且在circCSNK1G3-KD細胞中下調(diào)。綜上所述，circCSNK1G3至少部分地參與miR-181b/d相互作用來促進前列腺癌細胞增殖。

圖6 miR-181b/d部分挽救了circCSNK1G3的丟失

文章小結(jié)

本文旨在探討深層RNA序列中原發(fā)腫瘤的價值，并首次報道了具有功能注釋的circRNAs，揭示了一種與侵襲性導管內(nèi)癌組織學相關的線性轉(zhuǎn)錄亞型和一種區(qū)分局限性轉(zhuǎn)移性疾病的融合特征，并為后期RNA轉(zhuǎn)錄組研究提供豐富的資源。

與此同時，反式剪切事件表明了廣泛的RNA發(fā)生環(huán)化，在腫瘤細胞中平均有7232個circRNA表達，結(jié)合多個患者樣本數(shù)據(jù)分析得到circRNA產(chǎn)生的程度與疾病進展相關。功能缺失篩查發(fā)現(xiàn)11.3% 的高豐度circRNA對細胞增殖至關重要，其中90%與線性轉(zhuǎn)錄本并不相關。不同circRNA具有不同的特異性功能，例如circCSNK1G3通過與miR-181相互作用促進腫瘤細胞增殖。綜上所述，相對于線性轉(zhuǎn)錄本而言，circRNA顯示出獨特的本質(zhì)信息，對后期臨床研究具有重要的作用。

解析文獻

Chen S, Huang V, Xu X, et al. Widespread and functional RNA circularization in localized prostate cancer. Cell. 2019 Feb 7; 176(4): 831-843.

上一條：又一高分力作！ABHD5在調(diào)控結(jié)直腸癌化療反應中的潛在作用！

下一條：【新品速遞】石蠟包埋樣本蛋白質(zhì)組學

最新動態(tài)