又一高分力作！ABHD5在調控結直腸癌化療反應中的潛在作用！
信息來源：金開瑞 作者：genecreate 發布時間：2019-04-04 11:49:34
題目：ABHD5 blunts the sensitivity of colorectal cancer to fluorouracil via promoting autophagic uracil yield
期刊：Nature Communications
影響因子：12.353
主要技術：病毒包裝、蛋白表達
研究背景
結直腸癌（CRC）已成為世界上最常見的癌癥之一，自20世紀90年代初以來，氟尿嘧啶（FU）通過抑制胸苷酸合成酶來影響嘧啶合成并耗盡細胞內DTTP池，也通過影響RNA和DNA結合來干擾核苷酸代謝并最終導致細胞死亡。雖然作為單獨或聯合CRC化療方案中基礎效用藥物，但也面臨著嚴峻的耐藥性問題。
自噬是一種胞內組分的酶解代謝和循環更新過程，大量實驗結果表明，抗化療的腫瘤細胞在化療、放療和靶向藥物的挑戰下表現出自噬通量的上調，大多停止合成核糖體且消解多余的核糖體，因此操縱自噬過程可能是癌細胞對化療敏感的一種潛在機制。作者在前期研究基礎上，發現一種在CRC中具有腫瘤抑制作用的脂溶因子ABHD5，在人類CRC細胞中表達量顯著降低且與惡性特征負相關。重要的是，最新發現ABHD5通過調節自噬在維持染色體穩定性和保護基因組完整性方面發揮著關鍵作用，促使繼續深入探究ABHD5在調控結直腸癌化療反應中的潛在作用，并提供了ABHD5對基于FU輔助治療pMMR方案的建設性意見。
研究內容及結果
1. ABHD5降低了CRC細胞對FU的敏感性
作者采用癌癥藥物敏感性基因組學（GDSC）數據集，將ABHD5表達水平與化療相關的敏感性數據串聯起來。通過皮爾遜相關性分析，ABHD5表達在pMMR 和dMMR CRC細胞系中均與IC50呈現正相關的趨勢（圖1a）。在細胞功能學檢測中，相比較于pMMR-CRC細胞系的SW480細胞（對照組），MTT測定顯示ABHD5敲除細胞（ABHD5 KD）在FU處理下IC50值和細胞活力顯著降低（圖1b-1c），膜聯蛋白V/7AAD染色的流式細胞術測定顯示ABHD5 KD組在FU處理后細胞凋亡增加（圖1d）。在NOD-SCID 鼠的腹腔注射異種移植物（SW480 / ABHD5 KD和PBS / FU）后，ABHD5 KD+FU組腫瘤負荷顯著減小，說明ABHD5 KD組對FU的敏感性顯著增加（圖1e）且腫瘤細胞凋亡率增加（圖1f）。與此同時，作者將干預試驗調整為腫瘤特異性患者源性異種移植（PDX）模型，選定pMMR源性患者并隨機分成四個獨立的治療組：①pMMR/ABHD5 low+PBS、②pMMR/ABHD5 high+PBS、③pMMR/ABHD5 low+FU和 ④pMMR/ABHD5 high+FU，在腫瘤實體圖和腫瘤演變圖中發現pMMR/ABHD5 low+FU組明顯受益（圖1g-1h），再通過Caspase-3對凋亡細胞或Ki67對增殖細胞進行免疫染色和分析得到pMMR/ABHD5 low組在FU處理時顯著抑制細胞增殖并表現較強的敏感性（圖1i-1j）。
期刊：Nature Communications
影響因子：12.353
主要技術：病毒包裝、蛋白表達
研究背景
結直腸癌（CRC）已成為世界上最常見的癌癥之一，自20世紀90年代初以來，氟尿嘧啶（FU）通過抑制胸苷酸合成酶來影響嘧啶合成并耗盡細胞內DTTP池，也通過影響RNA和DNA結合來干擾核苷酸代謝并最終導致細胞死亡。雖然作為單獨或聯合CRC化療方案中基礎效用藥物，但也面臨著嚴峻的耐藥性問題。
自噬是一種胞內組分的酶解代謝和循環更新過程，大量實驗結果表明，抗化療的腫瘤細胞在化療、放療和靶向藥物的挑戰下表現出自噬通量的上調，大多停止合成核糖體且消解多余的核糖體，因此操縱自噬過程可能是癌細胞對化療敏感的一種潛在機制。作者在前期研究基礎上，發現一種在CRC中具有腫瘤抑制作用的脂溶因子ABHD5，在人類CRC細胞中表達量顯著降低且與惡性特征負相關。重要的是，最新發現ABHD5通過調節自噬在維持染色體穩定性和保護基因組完整性方面發揮著關鍵作用，促使繼續深入探究ABHD5在調控結直腸癌化療反應中的潛在作用，并提供了ABHD5對基于FU輔助治療pMMR方案的建設性意見。
研究內容及結果
1. ABHD5降低了CRC細胞對FU的敏感性
作者采用癌癥藥物敏感性基因組學（GDSC）數據集，將ABHD5表達水平與化療相關的敏感性數據串聯起來。通過皮爾遜相關性分析，ABHD5表達在pMMR 和dMMR CRC細胞系中均與IC50呈現正相關的趨勢（圖1a）。在細胞功能學檢測中，相比較于pMMR-CRC細胞系的SW480細胞（對照組），MTT測定顯示ABHD5敲除細胞（ABHD5 KD）在FU處理下IC50值和細胞活力顯著降低（圖1b-1c），膜聯蛋白V/7AAD染色的流式細胞術測定顯示ABHD5 KD組在FU處理后細胞凋亡增加（圖1d）。在NOD-SCID 鼠的腹腔注射異種移植物（SW480 / ABHD5 KD和PBS / FU）后，ABHD5 KD+FU組腫瘤負荷顯著減小，說明ABHD5 KD組對FU的敏感性顯著增加（圖1e）且腫瘤細胞凋亡率增加（圖1f）。與此同時，作者將干預試驗調整為腫瘤特異性患者源性異種移植（PDX）模型，選定pMMR源性患者并隨機分成四個獨立的治療組：①pMMR/ABHD5 low+PBS、②pMMR/ABHD5 high+PBS、③pMMR/ABHD5 low+FU和 ④pMMR/ABHD5 high+FU，在腫瘤實體圖和腫瘤演變圖中發現pMMR/ABHD5 low+FU組明顯受益（圖1g-1h），再通過Caspase-3對凋亡細胞或Ki67對增殖細胞進行免疫染色和分析得到pMMR/ABHD5 low組在FU處理時顯著抑制細胞增殖并表現較強的敏感性（圖1i-1j）。
圖1 ABHD5阻礙pMMR CRCs對FU的敏感性
2. ABHD5高表達的CRCs并不受益于基于FU的化療
采用StepMiner算法將NCBI-GEO數據集中361名pMMR-CRCs患者分為ABHD5 high組（262例）和ABHD5 low組（99例），并開展實驗來評估ABHD5與預后的關系以及基于FU輔助治療的益處（圖2a-2b），統計數據顯示ABHD5 high組更可能是BRAF突變陽性突變型（BRAF MT）、p53野生型（p53 WT）和染色體不穩定陰性型（CIN−），且在單獨接受FU手術治療后pMMR/ABHD5 high組的預后優于pMMR/ABHD5 low組（圖2c-2d）。進一步分析人類結腸癌組織微陣列數據，并將432例患者隊列分為兩組：pMMR/ABHD5 high（256例）和pMMR/ABHD5 low（176例），發現在單獨接受FU手術治療后，pMMR/ABHD5 high組明顯傾向于DFS延長的趨勢；pMMR/ABHD5 low組明顯受益于基于FU的輔助化療。
采用StepMiner算法將NCBI-GEO數據集中361名pMMR-CRCs患者分為ABHD5 high組（262例）和ABHD5 low組（99例），并開展實驗來評估ABHD5與預后的關系以及基于FU輔助治療的益處（圖2a-2b），統計數據顯示ABHD5 high組更可能是BRAF突變陽性突變型（BRAF MT）、p53野生型（p53 WT）和染色體不穩定陰性型（CIN−），且在單獨接受FU手術治療后pMMR/ABHD5 high組的預后優于pMMR/ABHD5 low組（圖2c-2d）。進一步分析人類結腸癌組織微陣列數據，并將432例患者隊列分為兩組：pMMR/ABHD5 high（256例）和pMMR/ABHD5 low（176例），發現在單獨接受FU手術治療后，pMMR/ABHD5 high組明顯傾向于DFS延長的趨勢；pMMR/ABHD5 low組明顯受益于基于FU的輔助化療。
圖2 ABHD5的表達以及FU的輔助化療療效
3. ABHD5通過提高自噬性尿嘧啶的產量來降低FU的攝取
接下來，作者深入探索ABHD5調節pMMR-CRC細胞對FU的反應機制。通過高效液相色譜測定發現相對于對照組，ABHD5 KD組的胞內FU濃度顯著增加（圖3a），且在蛋白質印跡分析中發現PBS或FU處理的細胞中均沒有發現胸苷酸合成酶（TS）、胸苷磷酸化酶（TP）和二氫嘧啶脫氫酶（DPD）的變化，推測胞內FU濃度與藥物吸收能力相關（圖3b）。有趣的是，在FU處理后的代謝曲線中，發現ABHD5 KD組的胞內尿嘧啶顯著減少（圖3c），而不影響嘧啶生物合成的限速酶CPS II和UMPS的變化（圖3d），推測ABHD5可能通過一種新的方式影響尿嘧啶的產量。
繼續研究GSE38832數據集中122例CRCs，ABHD5 low組溶酶體途徑相關成分的平均水平下降（圖3e）?；贏BHD5表達的分層聚類分析，推測出溶酶體RNA的降解介導自噬性尿嘧啶的產生（圖3f），熒光標記和高含量篩選（HCS）分析顯示自噬體通量與胞內FU水平呈負相關（圖3g-3h）。值得注意的是，ABHD5 OE組在FU和CQ（氯喹，靶向藥物）共同作用下有力地挽救了胞內尿嘧啶和FU的濃度（圖3i-3j），相關PDX模型中發現BA（BECN1激活劑）只是適度地逆轉ABHD5 KD組中胞內尿嘧啶和FU的濃度（圖3k-3l），說明ABHD5通過BECN1以外的機制調節自噬尿嘧啶的產生。
接下來，作者深入探索ABHD5調節pMMR-CRC細胞對FU的反應機制。通過高效液相色譜測定發現相對于對照組，ABHD5 KD組的胞內FU濃度顯著增加（圖3a），且在蛋白質印跡分析中發現PBS或FU處理的細胞中均沒有發現胸苷酸合成酶（TS）、胸苷磷酸化酶（TP）和二氫嘧啶脫氫酶（DPD）的變化，推測胞內FU濃度與藥物吸收能力相關（圖3b）。有趣的是，在FU處理后的代謝曲線中，發現ABHD5 KD組的胞內尿嘧啶顯著減少（圖3c），而不影響嘧啶生物合成的限速酶CPS II和UMPS的變化（圖3d），推測ABHD5可能通過一種新的方式影響尿嘧啶的產量。
繼續研究GSE38832數據集中122例CRCs，ABHD5 low組溶酶體途徑相關成分的平均水平下降（圖3e）?；贏BHD5表達的分層聚類分析，推測出溶酶體RNA的降解介導自噬性尿嘧啶的產生（圖3f），熒光標記和高含量篩選（HCS）分析顯示自噬體通量與胞內FU水平呈負相關（圖3g-3h）。值得注意的是，ABHD5 OE組在FU和CQ（氯喹，靶向藥物）共同作用下有力地挽救了胞內尿嘧啶和FU的濃度（圖3i-3j），相關PDX模型中發現BA（BECN1激活劑）只是適度地逆轉ABHD5 KD組中胞內尿嘧啶和FU的濃度（圖3k-3l），說明ABHD5通過BECN1以外的機制調節自噬尿嘧啶的產生。
圖3 ABHD5影響CRC細胞對FU的攝取
4. ABHD5維持RNASET2活性來促進自噬尿嘧啶的產生
如圖4a中尿嘧啶相關核苷酸降解途徑所示，采用超高效液相色譜-多反應監測質譜分析在FU作用下尿嘧啶和相關核苷含量的時間依賴性變化，相比于對照組，ABHD5 KD組中胞苷、尿苷和尿嘧啶的含量幾乎沒有增加（圖4b），可簡單地闡明RNASET2催化RNA分解過程并參與ABHD5誘導自噬性尿嘧啶的產生（圖4c）。值得注意的是，ABHD5 KD組和RNASET2 KD組中胞內的3’CMP、3’UMP、核苷含量均在產生后被消除（圖4d），但ABHD5 OE+RNASET2 KD組中顯著地逆轉了胞內尿嘧啶的產量（圖4e）并對FU重新敏感（圖4f-4g）。這些證據表明RNASET2在介導ABHD5誘導的自噬性尿嘧啶產生中起著關鍵作用。
如圖4a中尿嘧啶相關核苷酸降解途徑所示，采用超高效液相色譜-多反應監測質譜分析在FU作用下尿嘧啶和相關核苷含量的時間依賴性變化，相比于對照組，ABHD5 KD組中胞苷、尿苷和尿嘧啶的含量幾乎沒有增加（圖4b），可簡單地闡明RNASET2催化RNA分解過程并參與ABHD5誘導自噬性尿嘧啶的產生（圖4c）。值得注意的是，ABHD5 KD組和RNASET2 KD組中胞內的3’CMP、3’UMP、核苷含量均在產生后被消除（圖4d），但ABHD5 OE+RNASET2 KD組中顯著地逆轉了胞內尿嘧啶的產量（圖4e）并對FU重新敏感（圖4f-4g）。這些證據表明RNASET2在介導ABHD5誘導的自噬性尿嘧啶產生中起著關鍵作用。
圖4 RNASET2介導ABHD5誘導的自噬尿嘧啶產量
5. ABHD5保護RNASET2不被PDIA5滅活
通過免疫熒光染色來發現ABHD5的定位，以及蛋白質印跡法來檢測溶酶體溶解物中ABHD5的表達情況，說明ABHD5可能在溶酶體中定位并調節RNASET2 的活性（圖5a-5b）。盡管在Co-IP分析結果中ABHD5與RNASET2存在互作關系，但是酵母雙雜交試驗結果否定了兩者的直接互作（圖5c-5d），且WB顯示在對照組和ABHD5 KD組的溶酶體中RNASET2蛋白表達水平沒有變化（圖5e），表明ABHD5可能不直接調節RNASET2的活性。
接下來以HuProtTM蛋白芯片為基礎，采用人源ABHD5重組蛋白篩選出ABHD5與PDIA5直接互作并通過Co-IP分析證實（圖5f-5g）。通過蛋白質-蛋白質對接法預測出PDIA5的β片段是ABHD5和RNASET2互作的共同區域（5h），競爭性結合分析結合體外免疫印跡分析得到ABHD5與RNASET2競爭，直接結合PDIA5并影響其對RNASET2的失活調控（圖5i-5j）。基因敲除細胞和PDX的體外驗證實驗（5k-5m）表明，ABHD5定位于溶酶體，通過與RNASET2競爭來促進自噬性尿嘧啶的產生，從而減弱CRC細胞對FU的固有抵抗力。
通過免疫熒光染色來發現ABHD5的定位，以及蛋白質印跡法來檢測溶酶體溶解物中ABHD5的表達情況，說明ABHD5可能在溶酶體中定位并調節RNASET2 的活性（圖5a-5b）。盡管在Co-IP分析結果中ABHD5與RNASET2存在互作關系，但是酵母雙雜交試驗結果否定了兩者的直接互作（圖5c-5d），且WB顯示在對照組和ABHD5 KD組的溶酶體中RNASET2蛋白表達水平沒有變化（圖5e），表明ABHD5可能不直接調節RNASET2的活性。
接下來以HuProtTM蛋白芯片為基礎，采用人源ABHD5重組蛋白篩選出ABHD5與PDIA5直接互作并通過Co-IP分析證實（圖5f-5g）。通過蛋白質-蛋白質對接法預測出PDIA5的β片段是ABHD5和RNASET2互作的共同區域（5h），競爭性結合分析結合體外免疫印跡分析得到ABHD5與RNASET2競爭，直接結合PDIA5并影響其對RNASET2的失活調控（圖5i-5j）。基因敲除細胞和PDX的體外驗證實驗（5k-5m）表明，ABHD5定位于溶酶體，通過與RNASET2競爭來促進自噬性尿嘧啶的產生，從而減弱CRC細胞對FU的固有抵抗力。
圖5 ABHD5維持RNASET2的活性
文章小結
目前臨床上FU對CRC的療效已受到極大的耐藥性限制，盡管已知自噬與化療耐藥有關，但尚不清楚選擇性自噬降解在調節化療耐藥中的作用機制。在本研究中，作者首次揭示了ABHD5在調節溶酶體功能中的新作用，主要通過調節自噬尿嘧啶的產量使CRC對FU的敏感性起著關鍵作用，其定位于溶酶體并與PDIA5相互作用，以防止PDIA5與RNASET2相互作用并使RNASET2失活，并通過ABHD5缺陷型實驗佐證了相關結論，強調了ABHD5作為基于FU的CRC化療敏感性預測標志物的深遠意義。
解析文獻
Ou J, Peng Y, Yang W, et al. ABHD5 blunts the sensitivity of colorectal cancer to fluorouracil via promoting autophagic uracil yield[J]. Nature Communications, 2019, 10(1): 1078-1092.
目前臨床上FU對CRC的療效已受到極大的耐藥性限制，盡管已知自噬與化療耐藥有關，但尚不清楚選擇性自噬降解在調節化療耐藥中的作用機制。在本研究中，作者首次揭示了ABHD5在調節溶酶體功能中的新作用，主要通過調節自噬尿嘧啶的產量使CRC對FU的敏感性起著關鍵作用，其定位于溶酶體并與PDIA5相互作用，以防止PDIA5與RNASET2相互作用并使RNASET2失活，并通過ABHD5缺陷型實驗佐證了相關結論，強調了ABHD5作為基于FU的CRC化療敏感性預測標志物的深遠意義。
解析文獻
Ou J, Peng Y, Yang W, et al. ABHD5 blunts the sensitivity of colorectal cancer to fluorouracil via promoting autophagic uracil yield[J]. Nature Communications, 2019, 10(1): 1078-1092.
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