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去甲基澤蘭醛通過調節miR-30e-5p/MYBL2軸抑制膠質瘤的生長

信息來源：金開瑞作者：genecreate 發布時間：2019-06-20 09:33:12

題目：Demethylzeylasteral inhibits glioma growth by regulating the miR-30e-5p/MYBL2 axis

期刊：Cell Death and Disease（IF= 5.638）

主要技術：載體構建+雙熒光素酶實驗

研究背景

膠質瘤是最常見、最致命、低生存率的原發性腦腫瘤，其特征是高增殖、廣泛侵襲和神經系統破壞，且手術放療后預后相對較差，因此目前仍然急需更有效的治療策略。雷公藤屬于衛矛科植物，從中提取的去甲基澤蘭醛（T-96）是一種較低毒性的三萜類化合物，具有免疫抑制、抗炎和抗血管生成作用。在本篇文獻中，重點探究T-96在膠質瘤中的抗腫瘤活性，并初步確定T-96抑制腫瘤生長的作用機制，為膠質瘤的臨床治療提供一個新的方向。

研究內容及結果

1. T-96抑制人膠質瘤細胞的生長和增殖

作者首先采用LN-229、U-87、A-172、U-251和U-118細胞株來研究不同濃度的T-96下膠質瘤生長的影響，發現受試細胞的增殖均以劑量依賴性的方式顯著降低，且T-96對人腦膠質瘤細胞具有廣譜的抗腫瘤作用（圖1a）。通過MTT測定細胞活力、BrdU 染色分析細胞百分比、軟瓊脂法觀察菌落情況，統計后得到T-96顯著地抑制人膠質瘤細胞的生長和增殖（圖1b-1c）。

接下來，通過流式細胞儀初步檢測T-96對細胞周期的影響，發現T-96治療以劑量依賴的方式導致細胞在G1/S期顯著積累，從而抑制細胞生長和增殖（圖2a-2b）。再通過WB分析細胞周期相關蛋白（CDK 4、CDK6和cyclin D1）和分化標志物（GFAP 和 β3-tubulin）的表達水平，并結合顯微鏡觀察和流式細胞術來測定凋亡率（圖2c-2d），綜合得到T-96通過誘導細胞周期停止而不是凋亡來抑制膠質瘤細胞生長。

圖1 T-96抑制人膠質瘤細胞的生長和增殖

圖2 T-96導致人膠質瘤細胞G1/S細胞周期停滯

2. T-96抑制人膠質瘤細胞的遷移和侵襲

通過跨孔遷移和侵襲實驗，來初步評價T-96對人膠質瘤細胞（LN229、U-87和A-172）遷移和侵襲能力的影響，統計得到T-96處理后細胞遷移受到抑制且穿透的侵襲細胞數量顯著減少（圖3a-3d）。再結合WB測定E-鈣粘蛋白和波形蛋白的表達水平，得到T-96能強烈抑制膠質瘤細胞的遷移和侵襲能力、并逆轉了惡性膠質瘤細胞的上皮-間充質轉化（圖3e）。

圖3 T-96抑制人膠質瘤細胞的遷移和侵襲

3. T-96抑制與DNA復制和細胞周期進展相關的基因表達

為了進一步探究T-96抑制腫瘤細胞生長和增殖的機制，作者對T96和DMSO處理的膠質瘤細胞（（LN229和U-87）進行轉錄組分析。其中基因本體（GO）分析和KFGG分析顯示，與DNA復制和細胞周期進展相關的基因都是高豐度的且呈現下調的趨勢（圖4a-4b）；結合qRT-PCR和WB驗證差異基因的表達，得到與轉錄組一致的結果（圖4c-4d），T-96能顯著地抑制與DNA復制和細胞周期進展相關基因的表達水平。

圖4 T-96抑制與DNA復制和細胞周期進展相關的基因表達

4. MYBL2過表達可挽救T-96誘導膠質瘤細胞生長和周期停滯的抑制

前期已檢測到MYBL2在不同膠質瘤細胞系中廣泛表達，而通過qRT-PCR和WB驗證得到MYBL2的表達以劑量依賴和時間依賴的方式顯著下調（圖5a），說明MYBL2可能是T-96抑制膠質瘤細胞生長和增殖的關鍵因素。緊接著，開展拯救實驗來驗證假設，先通過慢病毒感染LN-229和A172細胞來構建MYBL2/EGFP過表達系，采用MTT分析一周內的細胞生長曲線（圖5b-5c），并結合BrdU染色分析細胞增殖情況（圖5d-5e），得出MYBL2過表達可挽救T-96誘導膠質瘤細胞生長的抑制。與此同時，通過流式細胞術分析MYBL2/EGFP過表達系的細胞周期、WB分析細胞周期蛋白（D1、CDKs、ORC6、CDC6、CDT1、MCMs和 CDC45）的表達水平（圖5f-5h），得到MYBL2過表達可挽救T-96誘導膠質瘤細胞周期停滯的抑制。

圖5 MYBL2是T-96抑制膠質瘤細胞生長和增殖的關鍵因素

5. T-96通過調節miR-30e-5p/MYBL2來抑制細胞增殖

鑒于在MYBL2/EGFP過表達系中，T-96治療后外源性MYBL2蛋白沒有顯著地降低，由此推測T-96可能在轉錄水平上抑制MYBL2的表達，繼而開展機制探究實驗。首先通過對MYBL2的3’UTR靶向miRNAs的分析和檢測，篩選出顯著上調的靶基因miR-30e-5p（圖6a）；其次應用mir-30e-5p拮抗物（Antago）進行細胞實驗，結合qRT-PCR檢測分析mir-30e-5p的表達水平（圖6b）、MTT法研究單獨或聯合處理的細胞增殖情況（圖6c）、WB驗證Antago組中細胞周期相關蛋白（CDK 4、CDK6和cyclin D1，圖6d-6f）的表達水平，得到T-96通過調節miR-30e-5p/MYBL2來抑制細胞增殖，且其中miR-30e-5p表達上調和MYBL2表達下調。

圖6 T-96通過調節miR-30e-5p/MYBL2來抑制細胞增殖

6. T-96抑制體內膠質瘤的生長

最后開展體內驗證實驗，將LN-229細胞皮下移植到裸鼠體內，來探究T-96在體內對膠質瘤生長的影響。統計生理數據得到，相比較于對照組，T-96治療后小鼠的腫瘤體積和重量顯著地降低（圖7a-7b）；結合免疫組化法檢測Ki67的表達水平、qRT-PCR檢測miR-30e-5p的表達水平、WB檢測分析MYBL2和細胞周期相關蛋白的表達水平，得到T-96還可能通過阻斷腫瘤異種移植小鼠的正常細胞周期進程來抑制膠質瘤細胞的生長（圖7c-7f）。與此同時，再進行原位植入實驗，來研究T-96在體內的抗腫瘤活性，發現可通過血腦屏障達到預期的靶點（圖7g-7h）；從整體層面上，完善了T-96抑制人腦膠質瘤細胞增殖和腫瘤進展的機制圖（圖7j）。

圖7 在體內評價了T-96的抗腫瘤作用

文章小結

本研究旨在探究T-96對膠質瘤的抗腫瘤活性，并首次揭示了T-96通過影響DNA復制來抑制膠質瘤生長、通過下調MYBL2導致G1/S細胞周期停滯的作用機制。一方面，T-96治療后膠質瘤細胞的侵襲和遷移被顯著地抑制，與DNA復制和細胞周期相關基因均顯著下調不同的是miR-30e-5p顯著地上調，結合MYBL2過表達系拯救實驗和miR-30e-5p拮抗劑驗證實驗表明兩者的參與機制；另一方面，在小鼠模型中，得出T-96通過阻斷腫瘤異種移植小鼠的正常細胞周期進程來抑制膠質瘤細胞的生長。綜上所述，T-96在體內和體外均可通過調節miR-30e-5p/MYBL2軸來抑制膠質瘤細胞的生長，并首次提出了T-96是一種有希望治療惡性膠質瘤的候選藥物。

解析文獻

Zhang K, Fu G, Pan GZ, et al. Demethylzeylasteral inhibits glioma growth by regulating the miR-30e-5p/MYBL2 axis. Cell Death Dis. 2018 June 9. DOI: 10.1038/s41419-018-108

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