首頁集團概況技術專題

多組學聯合揭示糖酵解和KEAP1-NRF2信號轉導的整合機制

信息來源：金開瑞作者：genecreate 發布時間：2019-12-31 11:31:43

期刊：Nature

IF：41.577

技術：定量蛋白質組、靶向代謝組、PRM

研究背景：

細胞代謝和信號調節整合對于維持細胞穩態是極其必需的。細胞內生、固有活性代謝物能夠調節蛋白質功能，進而影響細胞的生命活動。KEAP1是一種重要的“親電性傳感器”蛋白，可對內源性和外源性分子做出反應，其共價修飾會導致 NRF2 的累積，從而啟動細胞保護基因轉錄。因此，作者希望能揭示糖酵解和NRF2信號傳導之間的直接聯系。

研究結果：

1. IMR32細胞表型篩選，確定激活 NRF2信號傳導的化合物

為了發現KEAP1-NRF2信號傳導途徑的非共價調節因子，以及其潛在調節的新作用機制，作者使用NRF2依賴性熒光素酶報告基因（pTI-ARE-LUC）進行了基于IMR32細胞的高通量表型篩選。從多種雜環化合物庫中，作者鑒定到一種CBR-470-0化合物，其系列化合物（如CBR-470-1）處理IMR32細胞后可導致NRF2蛋白的積累呈現時間依賴效應（圖1b）。根據IMR32細胞（CBR-470-1處理24h后）表達譜顯示，最顯著富集的基因組是由NRF2靶基因組成的“NFE2L2 targets” （圖1c-1d），這表明CBR-470-系列化合物可以在體外誘導NRF2信號通路激活。

接下來，作者進一步確定CBR-470-系列化合物參與體內的誘導過程。Balb/C小鼠口服CBR-470-2化合物，通過qRT-PCR檢測在幾個器官中NRF2靶基因的表達情況，發現在皮膚中觀察到NQO1和HMOX1的轉物水平呈現劑量依賴性增加（圖1e）。已有研究表明NRF2可以有效防止紫外線照射導致的光老化表型和皮膚癌變，進而作者在急性UV損傷小鼠模型中評估CBR-470-2的活性，發現CBR-470-2可以減少紫外線照射后的小鼠模型表皮厚度，與NRF2細胞保護程序的激活一致（圖1g-1h）；由此表明CBR-470-系列化合物可以在體內誘導NRF2信號通路激活。

圖1 CBR-470-系列化合物在體外和體內均激活NRF2信號傳導

2. CBR-470-1激活NRF2信號傳導的機制

為了確定CBR-470-1激活NRF2信號傳導的機制，作者合成了含有生物素和二氮雜萘取代基的熒光親和探針（稱為CBR-470-PAP），并使用5μM劑量去處理IMR32細胞1小時，在紫外線照射后進行細胞裂解液的抗生物素蛋白質印跡分析（圖2a）；再接著通過生化分離和LC-MS/MS分析磷酸甘油酸激酶1（PGK1）是否作為CBR-470-PAP的潛在靶標（圖2b-2c）。體外重組蛋白的結合實驗表明CBR-470-PAP選擇性標記了PGK1；而IMR32細胞中PGK1蛋白的敲低和過表達實驗發現，CBR-470-1處理組的 EC50值分別表現出降低和增加（圖2d-2e），且烯醇酶1（PGK1下游的酶）消耗加快；靶向代謝物組學分析發現，CBR-470-1處理的IMR32細胞中PGK1 上游代謝物水平快速增加以及下游代謝物快速消耗；上述結果表明，糖酵解中間體可參與NRF2信號傳導，CBR-470-1可通過調節PGK1活性來影響糖酵解途徑和NRF2活化過程。

圖2 糖酵解依賴 CBR-470-1 激活 NRF2 信號傳導

3. MGx介導了糖酵解和KEAP1-NRF2信號通路的直接聯系

作者先研究由PGK1直接代謝的1,3-BPG是否可能通過由KEAP1的磷酸甘油基-賴氨酸（PGK）修飾來參與KEAP1-NRF2途徑的信號傳導。在CBR-470-1處理IMR32細胞30分鐘后，1,3-BPG水平升高，KEAP1水平沒有明顯改變；但是WB結果顯示CBR-470-1發生作用依賴于高分子量 KEAP1（HMM-KEAP1）的形成，其分子量大約是單體 KEAP1 的兩倍（圖3a）。除1,3-BPG外，其他糖酵解的中心代謝產物，如磷酸丙糖異構體D-甘油醛-3-磷酸（GAP）和磷酸二羥丙酮（DHAP），以及它們的非酶解產物甲基乙二醛（MGx），這些親電羰基化合物都可以作為反應官能團修飾蛋白殘基。在這些候選物中，僅有MGx處理的細胞裂解物或活細胞可導致HMW-KEAP1的選擇性形成（圖3b-3c），并功能性地激活下游NRF2靶基因NQO1和HMOX1的表達（圖3d）；同時衍生化MGx的靶向LC-MS檢測也證實CBR-470-1處理細胞的最初幾小時內MGx水平顯著地升高（圖3e）。因此上述結果說明糖酵解和由MGx直接修飾KEAP1介導的KEAP1-NRF2信號通路之間存在直接聯系。

圖3 MGx修飾KEAP1形成共價的高分子量二聚體并激活NRF2信號傳導

4. SILAC 定量蛋白質組學和PRM靶向蛋白質組學確定了影響 HMM-KEAP1 形成的關鍵結構域

接下來，作者進一步選用SILAC 定量蛋白質組學方法確定HMW的結構域和殘基（圖4a），結果表明NTR（N-末端區域，氨基酸1-50）和BTB結構域（氨基酸150-169）作為可能參與HMW的候選結構域和殘基，它們響應了CBR-470-1誘導的HMW-KEAP1二聚體形成過程（圖4b-4d）。同時，作者檢測了這些結構域內的十多個C-to-S，K-to-M/R和R-to-A突變，以及KEAP1中其他已知的功能殘基對HMW-KEAP1形成的影響；結果發現兩個精氨酸殘基突變（NTR結構域的R15和BTB結構域的R135）顯著但不完全地減少了HMW-KEAP1的形成，而BTB結構域中C151S突變對HMW-KEAP1形成的幾乎完全抑制（圖5a）。由此，作者通過合成一個含有半胱氨酸和精氨酸的模型肽，來確定MGx可能介導上述殘基之間的修飾；采用甘氨酸接頭分開模型肽，并在生理溫度和pH下用MGx處理過夜，可發現形成翻譯后修飾出新的甲基咪唑（MICA）。

隨后，作者在純化MICA后通過一系列一維和二維NMR實驗證實了其結構（圖5d）；并采用CBR-470-1或MGx處理細胞，經過凝膠分離HMW-KEAP1和單體KEAP1后進行LC-MS/MS分析，來確定是否在KEAP1蛋白內發生MICA修飾（圖5c-5d）。在來自CBR-470-1和MGx處理的分離的HMW-KEAP1中鑒定了在C151和R135之間具有MICA交聯肽，但在分離的單體KEAP1中未鑒定到（圖5e）。此外，PRM的并行反應監測也證實了HMW-KEAP1中獨特存在的十幾個母-子離子躍遷的存在和共洗脫的存在（圖5f；圖6a-6b）。綜上所述，作者發現糖酵解代謝過程是通過反應性糖酵解代謝物MGx與前哨蛋白KEAP1的直接相互作用來偶聯NRF2依賴性基因的表達，并形成穩定且新型的翻譯后修飾蛋白質來介導糖酵解途徑（圖5g）。

圖4 基于SILAC的KEAP1修飾蛋白質組學表征HMM-KEAP1結構域

圖5 甲基乙二醛在KEAP1中的近端半胱氨酸和精氨酸殘基之間形成新的翻譯后修飾

圖6 PRM分析MICA交聯肽

研究結論：

作者確定了糖酵解酶PGK1的小分子抑制劑，并揭示了糖酵解和NRF2信號傳導之間的直接聯系。PGK1的抑制導致活性代謝物MGx的積累，其選擇性地修飾KEAP1以便在近端半胱氨酸和精氨酸殘基（MICA）之間形成甲基咪唑交聯；該翻譯后修飾的過程導致KEAP1的二聚化、NRF2的積累和NRF2轉錄程序的激活。總的來說，在糖酵解和KEAP1-NRF2信號傳導之間存在著直接的通信聯系，由此更加深入地了解細胞應激反應后的代謝調控機制。

金開瑞推薦技術服務：

新技術的不斷涌現，加快了多組學研究向定量化、高通量的發展，在分子水平研究基因組學、轉錄組學、蛋白質組學和代謝組學，已成為人們發現生命化學物質基礎和深入了解其分子機制的新方向。

多組學數據整合分析，有利于系統性地研究臨床發病機理、確認疾病靶點，發現生物標志物與進行疾病早期診斷，從而對個體化治療和用藥指導發揮重要作用。

金開瑞現提供下述多組學技術服務，并贈送對應關聯分析：

多組學項目	贈送關聯分析類型
轉錄組+蛋白質組	轉錄組+蛋白質組定性分析轉錄組+蛋白質組定量關聯分析轉錄組+蛋白質組層次聚類分析轉錄組+蛋白質組GO、Pathway富集分析
蛋白質組+代謝組	蛋白質組+代謝組 PCA 比較分析差異蛋白+差異代謝物表達量相關性分析差異蛋白+差異代謝物Pathway分析蛋白質組+代謝組相關性分析（矩陣熱圖和相關性網絡）加權基因共表達網絡分析（WGCNA，≥15 sample）
轉錄組+蛋白質組+代謝組	表達量相關性分析差異表達分析 Pathway富集分析

活動進行中~ Label-free修飾引物

上一條：【客戶文獻分享】LINC01207和miR-143-5p的競爭機制促進胰腺癌細胞的自噬和凋亡

下一條：去甲基澤蘭醛通過調節miR-30e-5p/MYBL2軸抑制膠質瘤的生長

4480YY私人影院免费无码,九九热视频这里只有精品,亚洲无线乱码高清在线观看一区

多組學聯合揭示糖酵解和KEAP1-NRF2信號轉導的整合機制