長(zhǎng)鏈非編碼RNA LINC00473通過(guò)分泌microRNA-195-5p上調(diào)PD-L1促進(jìn)胰腺癌進(jìn)展

信息來(lái)源：金開(kāi)瑞作者：genecreate 發(fā)布時(shí)間：2019-07-26 09:00:23

題目：Long noncoding RNA LINC00473 drives the progression of pancreatic cancer via upregulating programmed death-ligand 1 by sponging microRNA-195-5p.

期刊：J Cell Physiol（IF= 4.522）

主要技術(shù)：雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)、AGO2-RIP、RNA pulldown

研究背景

胰腺癌（Pancreatic cancer ，PC）被認(rèn)為是致命的惡性腫瘤，伴隨著高死亡率和不良預(yù)后，其在全世界日益成為嚴(yán)重的健康負(fù)擔(dān)。雖然手術(shù)，化療和放射治療可以輕度緩解PC患者的癥狀，但由于缺乏有效的診斷標(biāo)志物在初始階段監(jiān)測(cè)PC及預(yù)測(cè)預(yù)后，PC仍然面臨不令人滿意的臨床結(jié)果。因此，迫切需要尋找其他可能的PC治療方法。最近，程序性死亡配體1（PD-L1），已被用于腫瘤治療，作為多種腫瘤的治療靶點(diǎn)，尤其是PC。PD-L1充當(dāng)T細(xì)胞活化的負(fù)調(diào)節(jié)分子，通過(guò)與PD-1的互做，改變免疫監(jiān)視狀態(tài)從而介導(dǎo)腫瘤進(jìn)展。在臨床結(jié)果不佳的PC患者中報(bào)告了PD-L1的過(guò)度表達(dá)。已經(jīng)證明幾種非編碼RNA可以下調(diào)PD-L1，從而提高靶向治療的治療效果。因此，該研究旨在研究lncRNA、miRNA在PC進(jìn)展中潛在的分子機(jī)制。

研究?jī)?nèi)容及結(jié)果

1. LINC00473 與PD-L1在PC中上調(diào)，miR-195-5p在PC中下調(diào)，并且PD-L1的高表達(dá)與預(yù)后不良有關(guān)

作者首先檢測(cè)了134例PC組織及20例正常胰腺組織，通過(guò)IHC發(fā)現(xiàn)PD-L1主要表達(dá)在細(xì)胞膜上，PC組織中PD-L1陽(yáng)性率（57.69％）顯著高于正常胰腺組織（23.53％，p <0.05；圖1）。此外，臨床病理資料分析顯示，PD-L1陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤分期、腫瘤大小、LNM和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（p <0.05），而與與年齡、性別、神經(jīng)周圍侵犯及腫瘤分化無(wú)關(guān)。隨后，對(duì)85例PD-L1陽(yáng)性及49例PD-L1陰性患者進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析，發(fā)現(xiàn)PD-L1陽(yáng)性的PC患者的總體存活期比PD-L1陰性的患者短（p <0.05；圖2），提示高表達(dá)的PD-L1與不良預(yù)后相關(guān)。

隨后，對(duì)于PC組織及正常組織中的LINC00473、PD-L1及miR-195-5p表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)相較于正常組織，LINC00473、PD-L1表達(dá)上調(diào)，而miR-195-5p表達(dá)下調(diào)（圖3a、b、c）。此外，作者還在正常胰腺細(xì)胞系H6C7及PC細(xì)胞系SW-1990、Panc-1、BxPC-3、AsPC-1及CAPAN-2檢測(cè)了LINC00473的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)相較于H6C7，LINC0047在所有PC細(xì)胞系中均表達(dá)較高，且在SW-1990中表達(dá)最高（圖3d），因此后續(xù)也選用SW-1990細(xì)胞系開(kāi)展機(jī)制研究。

圖1 PD-L1在PC組織中高表達(dá)

圖2 PD-L1高表達(dá)與PC患者總體生存率低下相關(guān)

圖3 LINC00473 與PD-L1在PC中上調(diào)，miR-195-5p在PC中下調(diào)

2. miR-195-5p可以靶向調(diào)控PD-L1的表達(dá)，過(guò)表達(dá)miR-195-5p可以通過(guò)下調(diào)PD-L1表達(dá)抑制PC進(jìn)展

通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)可以發(fā)現(xiàn)，miR-195-5p和PD-L1存在可能的互作位點(diǎn)（圖4a）。隨后通過(guò)雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)野生型的PD-L1序列組通過(guò)mimics過(guò)表達(dá)miR-195-5p后熒光強(qiáng)度下降；而將預(yù)測(cè)到的miR-195-5p和PD-L1結(jié)合位點(diǎn)突變之后熒光強(qiáng)度恢復(fù)到對(duì)照組水平，說(shuō)明miR-195-5p和PD-L1的確可能通過(guò)該位點(diǎn)發(fā)生互作（圖4b）。加入miR-195-5p mimics后可以發(fā)現(xiàn)PD-L1的mRNA及蛋白水平均出現(xiàn)了下降，和加入PD-L1的抑制劑Atezolizumab后的情況類似（圖4c、d、e）。上述實(shí)驗(yàn)說(shuō)明miR-195-5p可以靶向下調(diào)PD-L1的表達(dá)。

接著，分別采用EdU染色、TUNEL染色、細(xì)胞劃痕和transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了miR-195-5p對(duì)SW-1990腫瘤生物學(xué)指標(biāo)的影響，發(fā)現(xiàn)miR-195-5p過(guò)表達(dá)可以抑制細(xì)胞增殖（圖5a、b），增加細(xì)胞凋亡（圖5c、d），降低細(xì)胞遷移和侵襲能力（圖5e、f、g、h）。同時(shí)，miR-195-5p過(guò)表達(dá)還可以調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白BCL-2、Bax，細(xì)胞遷移侵襲相關(guān)蛋白MMP2、MMP9（圖5i、j、k）。對(duì)上述因子的調(diào)控均和PD-L1抑制劑Atezolizumab的效果一致，說(shuō)明miR-95-5p可能通過(guò)下調(diào)PD-L1表達(dá)抑制PC進(jìn)展。

圖4 miR-95-5p靶向下調(diào)PD-L1的表達(dá)

圖5 miR-95-5p可以通過(guò)下調(diào)PD-L1表達(dá)抑制PC進(jìn)展

3. LINC00437可以miR-159-5p的ceRNA形式上調(diào)PD-L1表達(dá)，而當(dāng)LINC00437表達(dá)下調(diào)時(shí)PC進(jìn)展亦受抑制

原位熒光雜交顯示LINC00437主要定位在細(xì)胞質(zhì)（圖6），提示其作為ceRNA的可能。隨后采用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)了LINC00437與miR-159-5p潛在的結(jié)合位點(diǎn)（圖7a）。在采用雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)LINC00437和miR-159-5p的確可能在上述位點(diǎn)發(fā)生互作后，作者接下來(lái)分別采用AGO2-RIP與RNA pulldown確定了LINC00437和miR-159-5p的互作關(guān)系。當(dāng)干擾LINC00437表達(dá)后，miR-159-5p表達(dá)顯著上升，PD-L1表達(dá)顯著下降；而當(dāng)同時(shí)干擾LINC00437與miR-159-5p后，PD-L1的表達(dá)恢復(fù)到對(duì)照組水平。PD-L1蛋白的表達(dá)也存在同樣趨勢(shì)。上述實(shí)驗(yàn)說(shuō)明LINC00437可以結(jié)合并調(diào)控miR-159-5p，并通過(guò)其調(diào)控PD-L1的表達(dá)。

繼續(xù)分別采用EdU染色、TUNEL染色、細(xì)胞劃痕和transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LINC00437對(duì)SW-1990細(xì)胞腫瘤生物學(xué)指標(biāo)的影響，發(fā)現(xiàn)干擾LINC00437過(guò)表達(dá)可以抑制細(xì)胞增殖（圖8a、b），增加細(xì)胞凋亡（圖8c、d），降低細(xì)胞遷移和侵襲能力（圖8e、f、g、h）。同時(shí)，LINC00437低表達(dá)還可以調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白BCL-2、Bax，細(xì)胞遷移侵襲相關(guān)蛋白MMP2、MMP9（圖8i、j、k）。同時(shí)，挽救實(shí)驗(yàn)也證實(shí)同時(shí)干擾LINC00437與miR-159-5p表達(dá)后細(xì)胞腫瘤生物學(xué)指標(biāo)得到回復(fù)，說(shuō)明LINC00437對(duì)細(xì)胞腫瘤進(jìn)程的影響是通過(guò)miR-159-5p介導(dǎo)的。

圖6 LINC00437主要定位在細(xì)胞質(zhì)

圖7 LINC00437可以ceRNA形式通過(guò)miR-159-5p調(diào)控PD-L1的表達(dá)

圖8 LINC00437低表達(dá)可以抑制PC進(jìn)展

4. LINC00473可通過(guò)吸附miR-195-5p調(diào)控PD-L1表達(dá)，從而影響CD8+細(xì)胞活化

在SW-1990細(xì)胞中干擾LINC00473及miR-195-5p后，將這些細(xì)胞與CD8+細(xì)胞共孵育，隨后采用ELISA檢測(cè)了細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子的含量，發(fā)現(xiàn)干擾LINC00473表達(dá)組可導(dǎo)致促瘤細(xì)胞因子IL-10濃度下降，抑瘤細(xì)胞因子IFN-γ與IL-4濃度上升；而同時(shí)干擾LINC00473與miR-195-5p組上述細(xì)胞因子濃度均回歸到對(duì)照組水平（圖9a）。繼續(xù)檢測(cè)共培養(yǎng)處理后的CD8+細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，干擾LINC00473表達(dá)組CD8+細(xì)胞凋亡減少，PD-1及PD-L1表達(dá)減少；同時(shí)干擾LINC00473與miR-195-5p組CD8+細(xì)胞凋亡水平及PD-1、PD-L1表達(dá)水平與對(duì)照組相當(dāng)；過(guò)表達(dá)LINC00473組CD8+細(xì)胞凋亡水平上升，PD-1及PD-L1表達(dá)增加（圖9）。

圖9 LINC00473過(guò)表達(dá)影響CD8+細(xì)胞活化

文章小結(jié)

在PC細(xì)胞中，LINC00473作為結(jié)合miR-195-5p的ceRNA發(fā)揮功能，上調(diào)PD-L1及其受體PD-1，從而抑制CD8+ T細(xì)胞活化并促進(jìn)PC的進(jìn)展；LINC00473沉默或過(guò)表達(dá)miR-195-5p過(guò)下調(diào)PD-L1及其受體PD-1抑制細(xì)胞增殖，遷移和侵襲，促進(jìn)PC的細(xì)胞凋亡，從而防止PC的發(fā)生。