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?技術(shù)貼|ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果不理想？看這里！

信息來源：金開瑞作者：genecreate 發(fā)布時(shí)間：2019-11-15 16:06:45

前幾期小編已經(jīng)和大家分享了WB和IHC實(shí)驗(yàn)中常見問題及解決方案，這期咱們聊聊ELISA實(shí)驗(yàn)中的那些糟心事。那ELISA實(shí)驗(yàn)中都有哪些糟心事呢？我們一起來吐槽吐槽啊，高背景經(jīng)常遇見吧？遇見白板是不是很頭疼？顯色淡也不陌生吧，更別說重復(fù)性不好了～真叫人頭大！莫慌，請聽小編為大家一一解答，逐個(gè)擊破！

1、高背景/非特異性染色

結(jié)果描述	可能的原因	建議或預(yù)防措施
終止后，整板結(jié)果顯現(xiàn)均一的黃色或淡黃色；或標(biāo)曲有線性但背景過高	整板發(fā)黃現(xiàn)象可能由于錯(cuò)加其他試劑造成	實(shí)驗(yàn)前檢查試劑的組分及批號，確認(rèn)所有組分均屬于對應(yīng)的試劑盒。不同試劑盒或不同批號的試劑不能混用
	未充分清洗酶標(biāo)板	確保清洗過程中每個(gè)微孔所加入洗滌液量一致。清洗完成后，將酶標(biāo)板用力按壓在吸水紙上，以除去殘余的緩沖液
	孵育時(shí)間過長	嚴(yán)格按照說明書操作
	酶標(biāo)記物污染了吸頭及盛放顯色劑容器或陽性對照污染了微孔	吸取不同的試劑時(shí)應(yīng)更換吸頭，配置不同的試劑組分時(shí)，應(yīng)使用不同的儲液器皿。操作時(shí)請使用移液器
	檢測抗體或Avidin-HRP的濃度過高	檢查濃度計(jì)算是否正確或進(jìn)一步稀釋后再使用
	底物在使用前曝光或污染	加入底物前，應(yīng)始終避光保存
	顯色時(shí)間過長	嚴(yán)格按照說明書顯色時(shí)間操作
	讀取吸光值時(shí)使用了錯(cuò)誤的濾光片	TMB為底物時(shí)應(yīng)在450nm波長讀取吸光值，并以650nm作為校正波長

2、白板

結(jié)果描述	可能的原因	建議或預(yù)防措施
顯色步驟結(jié)束后，酶標(biāo)板所有孔均無顏色。陽性對照不顯色	組分試劑混淆使用	配制或使用時(shí)應(yīng)看清楚標(biāo)簽。
	洗板及加樣過程中，酶標(biāo)物受污染失活失去催化顯色劑顯色的能力	確認(rèn)盛酶標(biāo)的容器不含酶抑制劑（如NaN3等），確認(rèn)配制洗液的容器已洗干凈。
	遺漏了某種試劑或某個(gè)步驟	詳細(xì)審閱說明書，并嚴(yán)格遵循操作步驟。

3、顯色淡

結(jié)果描述	可能的原因	建議或預(yù)防措施
包括標(biāo)曲、樣本在內(nèi)的所有板孔顏色均較淡。	試劑盒超過有效期或儲存不當(dāng)	請?jiān)谟行趦?nèi)使用，并按照說明書推薦的保存條件保存，避免污染
	試劑、樣品用前未平衡	所有試劑、樣品應(yīng)置室溫平衡 30min左右
	移液器吸量不足，移液抽吸排放太快，吸頭內(nèi)壁掛液太多或內(nèi)壁不清潔	校正移液器，吸頭要配套，每次吸頭要吻合緊密。移液不宜過快，排放應(yīng)完全。吸頭內(nèi)壁要清潔，最好一次性使用
	孵育反應(yīng)時(shí)間不足	定時(shí)器準(zhǔn)確定時(shí)
	顯色反應(yīng)時(shí)間不足	一般在15-30min，20min為佳，特殊除外
	顯色劑加入順序顛倒（雙組分）	請嚴(yán)格按說明書
	洗滌次數(shù)增加，濃縮洗液稀釋倍數(shù)不符合要求	減少洗滌沖擊力，按說明書要求稀釋濃縮洗液、洗滌時(shí)間，準(zhǔn)確記錄洗滌次數(shù)及用量
	蒸餾水水質(zhì)有問題	配制好的洗液一定要檢測PH值是否呈中性
	洗板及加樣過程中，酶標(biāo)物受污染失活而失去催化顯色劑顯色的能力	確認(rèn)盛酶標(biāo)的容器不含酶抑制劑（如NaN3等），確認(rèn)配制洗液的容器已洗干凈，確認(rèn)配制洗液的純化水達(dá)到要求且未受污染
標(biāo)曲正常，樣本顯色較淡.	樣本使用NaN3防腐，抑制了酶的反應(yīng)	樣本不可使用NaN3
標(biāo)曲正常，樣本顯色較淡.	待測標(biāo)本中可能不含強(qiáng)陽性標(biāo)本，故結(jié)果可能是正常的	如有懷疑，可復(fù)檢
目測結(jié)果正常，但酶標(biāo)儀讀值偏低	讀取吸光值時(shí)使用了錯(cuò)誤的濾光片	TMB為底物時(shí)應(yīng)在450nm波長讀取吸光值，并以650nm作為校正波長

4、標(biāo)準(zhǔn)曲線不佳/重復(fù)性不好

結(jié)果描述	可能的原因	建議或預(yù)防措施
重復(fù)性差	標(biāo)準(zhǔn)品配制有誤	嚴(yán)格按照說明書標(biāo)準(zhǔn)品配制進(jìn)行操作。僅使用推薦的稀釋液對標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行稀釋
	試劑盒儲存方法不當(dāng)或儲存環(huán)境太差	請?jiān)谡f明書推薦的保存條件下保存，不要將重懸后的組分在室溫放置時(shí)間過長
	過早稀釋各工作組分	各工作組分請?jiān)谑褂们?0分鐘配制，并立即加入到微孔中
	樣本加入后未混勻	針對同時(shí)加入多種試劑組分，加樣后在混勻器上充分混勻。注意穩(wěn)拿穩(wěn)放，防止外濺
	酶標(biāo)儀測定重復(fù)性差	校準(zhǔn)酶標(biāo)儀
	孵育時(shí)間、洗滌條件、顯色條件、操作人員不一致	重復(fù)測定標(biāo)本，反應(yīng)條件、人員等盡可能與上次保持一致
	洗滌不正確	移液器準(zhǔn)確加入200μl/孔洗滌液或注滿各孔，但不要溢出。洗板機(jī)洗板時(shí)不應(yīng)有堵孔，洗滌應(yīng)充分
	孵育溫度恒溫效果不好	保證溫度恒定，避免局部溫度過高過低
	加液時(shí)，過多殘留于孔壁上	加液時(shí)，吸頭在不碰到孔底的前提下盡量沿著孔壁下方加液
	耗材重復(fù)使用	吸取不同的試劑時(shí)應(yīng)更換吸頭，配置不同的試劑組分時(shí)，應(yīng)使用不同的儲液器皿
	微孔底部被劃傷或存在污垢	操作時(shí)細(xì)心，注意不要觸碰底部。擦拭酶標(biāo)板底部，以去除污垢或指紋
	閾值附近時(shí)陰時(shí)陽	同一樣品做3個(gè)復(fù)孔，以2個(gè)（含2個(gè)以上相同結(jié)果為準(zhǔn)）
	加樣時(shí)交叉污染	加標(biāo)本時(shí)盡量避免交叉污染
出現(xiàn)隨機(jī)性的花板、跳孔現(xiàn)象	手工洗板造成的交叉污染	手工洗板時(shí)前 3次注洗液后應(yīng)立即棄去，后幾次再設(shè)定浸泡時(shí)間，可減少交叉污染
	拍板時(shí)交叉污染	拍板時(shí)用合適的吸水紙巾，不要把無關(guān)物質(zhì)拍進(jìn)板孔，并盡量不要在同一位置拍，以免交叉污染
	洗板機(jī)加液頭堵塞導(dǎo)致加液不滿或吸液殘留量較大，造成花板、跳孔	疏通加液頭，使洗板時(shí)每孔均注滿洗液，吸液時(shí)殘留量要小
	樣本離心處理不全，致使反應(yīng)孔內(nèi)發(fā)生凝血現(xiàn)象或存在沉淀物或殘留細(xì)胞成分干擾	血清血漿應(yīng)充分離心，3000rpm 6min以上
	樣品放置時(shí)間過長，污染	樣品應(yīng)保持新鮮，或低溫保存，防止污染
	洗滌液配制有誤或直接誤用濃縮洗滌液	按說明書配制

金開瑞試劑盒及膠體金服務(wù)擁有完善的ELISA試劑盒、膠體金免疫層析、熒光免疫層析開發(fā)平臺，專業(yè)的研發(fā)技術(shù)人員，結(jié)合成熟的抗原、抗體研發(fā)系統(tǒng)，可從事科研及診斷靶點(diǎn)的試劑盒、膠體金的研發(fā)以及抗原和抗體的標(biāo)記、樣本代測、試劑盒及膠體金的組裝等定制服務(wù)。

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