【上期看點】金開瑞CEO支付寶余額不足不足不足不足......
信息來源：金開瑞 作者：genecreate 發布時間：2020-07-31 09:34:27
7月28日晚8點金開瑞PCR直播首秀你看了嗎？
給你印象最深刻的
是振奮人心的支付寶口令紅包？
是有才有顏的主播小哥哥小姐姐？
還是一瞬間拉回實驗室的雙面板移液槍？
亦或是戳破屏幕卻失之交臂的代金券？
還是和小編一樣腦海中回蕩著
金開瑞CEO支付寶余額不足不足不足不足......
（錯過直播的寶寶們可以去看本場視頻的回放）
好了，言歸正傳
我們金開瑞的直播是要將理論和實操相結合，讓各位老師/同學清晰地知道實驗是怎么做的，從最基礎的分子生物學實驗到高通量篩選的組學實驗，從基因合成到蛋白表達再到抗體制備，從細胞實驗（體外實驗））再到動物實驗（體內實驗），我們會通過線上線下同步直播實操的方式讓大家一 一了解實驗流程，讓大家不再只停留在理論部分，以后每周二晚上八點，我們都在直播間不見不散！
下周二晚8點我們的直播主題也已經定下來了，各位可以先掃碼預約直播，以免錯過精彩瞬間。
那在直播開始之前，咱先聊點理論~
Oligo DNA的人工化學合成始于50年代初期，1980年，全自動的固相DNA合成儀面市后，使得快速、高效合成Oligo DNA成為可能，這大大地推動了生物工程技術的蓬勃發展。現在一般都采用β-乙腈亞磷酰胺化學合成Oligo DNA，將DNA固定在固相載體上完成DNA鏈的合成的合成時從3' →5' 方向進行，通常3' 端的第一個堿基結合在Glass擔體 (Controlled Pore Glass，CPG)上。其具有高效、快速的偶聯以及起始反應物比較穩定的特點。
1、合成步驟
- Step1：脫掉附加在CPG擔體上的第一個堿基5' -OH基團上的保護基 (DMTr)，準備附加下一個新的堿基；
- Step2：活化新的堿基單體 (Phosphoramidite)，準備與第一個堿基進行反應；
- Step3：第二個堿基與第一個堿基發生偶聯反應；
- Step4：將沒有反應的第一個堿基的5' -OH加帽封死 (Capping)，使其不再進一步參與反應；
- Step5：將核苷亞磷酸酯氧化成更穩定的核苷磷酸酯 (即將三價磷氧化成五價磷)。
- Step6：重復進行Step1～Step5的循環，直至合成完所需的Oligo DNA序列；
- Step7:合成結束后，將Oligo DNA分子從CPG上切下，再進行進一步的純化。
2、OD數的確定
一般PCR擴增，2 OD引物，可以做200-500次50ul標準PCR反應。如果是做基因拼接或退火后做連接，1 OD就足夠了。但是有些研究人員，就做幾次PCR，但是卻要5-10 OD。做全基因構建的引物都比較長，但是我們有些研究人員也要求高OD數。片段越長, 最后全長得率就越低，出錯的幾率就越大。超出需要之外的OD數要求，也是一種浪費。
3、引物純度檢測
實驗室方便的做法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝膠進行電泳。取0.2-0.5OD的引物，用尿素飽和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到飽和，上樣前加熱變性(95℃,2mins)。加入尿素的目的一是變性，二是增加樣品比重，容易加樣。600V電壓進行電泳，一定時間后(約2-3小時)，剝膠，用熒光TLC板在紫外燈下檢測帶型，在主帶之下沒有雜帶，說明純度是好的。如果條件許可，也可以用EB 染色或銀染方式染色。
4、引物級別選擇
5、引物純化方式
一般純化方式
目前，采用的主打的引物純化方式是脫鹽純化。其只能純化掉引物中的鹽分，并不能去除含的小片段，價格較為便宜，能滿足一般常規的應用。
1）C18柱
又稱為簡易反相柱，對DNA有特異性吸附，可被有機溶液洗脫，但不會被水洗脫。因此能有效地去除鹽分，但不能有效去除比目的片段短的小片段。該方法一般不會對普通PCR反應產生影響。對于需要用于測序、克隆的引物不能使用這個級別。
2）OPC純化
采用寡核苷酸純化柱 (Oligonucleotide Purification Cartridge，OPC)純化，制品純度保證80 ~ 90%。此級別制品可用作PCR引物、DNA測序引物、各種探針等。該級別只提供長度在35 mer以下的合成DNA制品。序列更長時，制品的純度得不到保證。
3）HAP純化方法
HAP（High Affinity Purification）其原理是利用合成引物5'-端DMT基團對HAP樹脂專一性吸附，而不含DMT的短鏈DNA不被吸附，從而達到分離純化的目的。制品純度可達到80~90%，可以滿足雜交探針、測序、常規PCR（不再做進一步克隆實驗）等用途了。但是因為其專一性吸附 DMT 能力有限，不免仍然有短片段帶入的可能，而且負載量小。特別是對長于39 堿基以上的片段純化效果不好。此級別只提供長度在10-39mer以下的合成oligo DNA制品。序列更長時，制品的純度得不到保證。
4）RPC純化
RPC純化是通過反相凈化濾芯 (Reverse Phase Cartridge) 對引物進行純化，純化原理與反相HPLC純化一樣。與反相HPLC比較，RPC是一種有效且更加經濟的純化方式。反相凈化濾芯通常包含一種疏水基質如 C18的硅膠，能夠很好的吸附DNA，并且可以用水輕松地將切割下來的保護基團和短的引物片段從反相柱上洗掉。RPC純化的引物可以應用于DNA測序、 PCR及基因合成等。
5） TON純化
基于特異和反相層析法，從合成好的產物中去除失敗序列，提供最終的目標序列。適于35個堿基以下的引物。毛細管電泳（Capillary Electrophoresis）純度大于75%。
PAGE純化方式
PAGE純化價格適中，純度較高，能滿足大多數應用，尤其是長度大于50個堿基的長鏈引物。
1)經典PAGE純化
PAGE (Polyacrylamide Gel Electrophoresis)，該方法是使用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，對DNA片段進行分離，然后從凝膠中回收目的DNA的方法。PAGE純化基于尺寸和構象分離全長產物和失敗序列，可以分離相差一個堿基的引物(120堿基以內)，從而提供高純度的引物。純化后的DNA純度大于90%，相比與其他純化方法，PAGE純化對長鏈Oligo DNA (大于50 mer)的純化特別有效，制品純度保證90 ~ 95%。如訂購的DNA欲用作RT-PCR引物、各種探針，或用于PCR克隆測序、定點突變等，請選用PAGE純化制品。
2)ULTRA PAGE純化
理論上分析型PAGE變性電泳，可以區分引物之間一個堿基的差別。經過PAGE純化的引物，特別是長引物要的量都比較高，上樣量都是非常大，電泳時的條帶往往比較寬，帶與帶之間有重疊，分辨率有所下降，電泳后割帶回收目的引物時，導致割的條帶有時可能比較寬，很難避免割到差別僅一個或幾個堿基的引物。因此，將原有的PAGE純化方式升級優化為現在的ULTRA PAGE純化方式，即在PAGE純化的同時配合質譜對DNA進行定性分析，以保證回收片段的正確性。
HPLC純化方式
價格最高，純度也最好，適用于小于40個堿基的未修飾寡核苷酸，用于定點突變、克隆、蛋白結合凝膠遷移電泳分析、治療用途。HPLC純化是使用高效液相色譜的原理，對DNA片段進行純化。純度可以大于99%。主要用于短鏈和修飾引物的純化。該法的弱點是成本較高，批量生產效率不高。
好了，理論部分就介紹到這里了，更多精彩請鎖定我們的直播！
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這里有活動開朗讓科研變得更有溫度的主播小姐姐小哥哥
本期更邀請了我們金開瑞營銷中心副總經理 楊總
聊得了技術，談得了合同，還能跨界做直播！
2020年8月4日（周二）晚8點
金開瑞引物合成與純化實驗直播等你來！
再多實驗需求，實力超強金開瑞也竭盡全力助您一一實現。
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