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知無不“研”| 一文讀懂RNA pull down（內含講座回放和限時活動）

信息來源：金開瑞作者：genecreate 發布時間：2020-07-31 09:50:54

RNA與蛋白質的相互作用是細胞生理過程得以實現的決定性因素之一。近年來，隨著技術的改進和新方法的建立，RNA和蛋白質的相互作用研究取得了長足進步。目前科研人員已經鑒定了較多RNA上的蛋白質結合位點，也發現了許多蛋白質中的RNA結合結構域，并對它們的結構特征進行了比較詳細的研究。這些為最終探明RNA和蛋白質相互作用的分子機制，從而從本質上認識相關的細胞生理過程打下了堅實的基礎。

RNA pull-down作為研究RNA與蛋白互作的核心技術，已成為研究焦點。RNA pull down是使用體外轉錄法標記生物素RNA探針，然后與胞漿蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白質復合物。該復合物可與鏈霉親和素標記的磁珠結合，從而與孵育液中的其他成分分離。復合物洗脫后，通過WB實驗檢測特定的RNA結合蛋白是否與RNA相互作用，或者結合MS篩選RNA結合的未知蛋白。

（圖片來源于https://mp.weixin.qq.com/s?src=11&timestamp=1596086144&ver=2491&signature=hzHhXJa1Y9zfIfsop8dfex102z*onK8Er65*dwvfNBGTIdDx7gwjAvWyAVqjYH3qmBEDYJGO8bdCQtPsVNrnAF1BznSRuIGKZozI23XKrgUJTCjaKf*x*M8YJLbsAUIQ&new=1）

RNA pull down技術應用

癌癥腫瘤相關調控機制研究

LncRNA發揮功能的方式很廣，可以與蛋白、DNA和RNA相互作用，參與多種生物學過程的調控。主要包括基因組表觀遺傳修飾、調控轉錄后翻譯、發揮ceRNA、增強子RNA作用等，從而對細胞的增殖、分化、遷移、凋亡、免疫等發揮調控作用。

lncRNA能夠通過對腫瘤細胞糖代謝、谷氨酰胺代謝和脂類代謝途徑中的關鍵環節進行調節，導致腫瘤細胞對葡萄糖攝取增加、谷氨酰胺分解增強及脂質生成增加，從而促進腫瘤的發生和發展。目前，大多數lncRNA在腫瘤細胞能量代謝中的功能和調控機制尚不完全清楚，進一步認識和了解腫瘤細胞中與lncRNA相關的能量代謝異常表現出的惡性生物學行為，將有助于為腫瘤的診斷和治療提供有效的證據及新的思路和途徑。

環狀RNA（circular RNA，circRNA）是近來研究很熱門的一種特殊的長鏈非編碼RNA。研究發現，circRNA 在人體細胞中廣泛表達，在轉錄后水平具有調控基因表達的重要功能，并且參與多種腫瘤和其他疾病的病理發展過程。

circRNA大多由外顯子序列組成，呈閉合環狀結構，性質穩定，高度保守性，通過微小RNA“海綿”作用調控靶基因表達，與腫瘤的發生、發展相關。這些特性使circRNA有潛力成為腫瘤新型分子診斷標志物。通過競爭性與腫瘤相關微小RNA的結合，可以開發針對circRNA分子靶點的靶向治療藥。因此,circRNA在腫瘤轉化醫學研究中意義巨大。

多種人類疾病研究

RBPs在轉錄后水平參與調控mRNA穩定性、LncRNA活性、應激、腫瘤發生發展、細胞凋亡等眾多生物學過程，且與諸多人類疾病密切相關。因此，對RBPs-RNAs相互作用網絡的研究和鑒定有重要意義。但由于RBPs作用方式復雜、功能多樣性、作用空間位置多樣化等原因，對其開展精確研究一直是一個重大挑戰。RNA領域，尤其是非編碼RNA研究的快速發展，催生了多種RBPs-RNAs相互作用鑒定技術。

RNA pull- down實驗常見問題

RNA結合蛋白的親和力不夠

可能的原因：1)結合緩沖環境沒有優化；2)裂解不完全；3)磁珠用量不足；4) RNA探針用量不足
解決方案：1)優化孵育時間、溫度、鹽濃度等條件；2)增加裂解液和蛋白上樣量的比例；3)增加裂解液；4)增加磁珠或探針用量；5)確定生物素和漣霉親和素效率

RNA結合蛋白沒有結合

可能的原因：1)靶蛋白量不足；2)緩沖體系不對；3)RNA探針和蛋白的親和力本來就低
解決方案：1)增加上樣蛋白量；2) 應用低鹽體系；3)加入交聯試劑

WB信噪比高

可能的原因：1)陽性信號率低；2)一抗效率低；3)蛋白沒有充分沽解
解決方案：1)增加抗的量；2)用敏感度的化學發光液；3)用細胞裂解液預孵-抗；4)增加樣品的量；5) 確定有沒有其他可能的結合情況；6)增加裂解液用量

結合的非特異性高

可能的原因：1)緩沖環境沒有優化；2)緩沖環境嚴謹性低；3)樣品沒有裂解完全和裂解體系沒有優化
解決的方案：1)優化孵育時間溫度鹽濃度等條件；2)使用嚴謹性高的緩沖體系；3)調低RNA探針和樣品的比例；4)提高裂解液的量

案例展示

案例一

題目：The STAT3-Binding Long Noncoding RNA lnc-DC Controls Human Dendritic Cell Differentiation

小結：RNA pull-down設置實驗組及反義鏈對照組，銀染找出差異條帶進行膠條質譜鑒定，分析結果篩選得到STAT3蛋白，進一步通過RIP-qPCR反向驗證，證實STAT3蛋白可以與lnc-DC結合。

Lnc-DC pull-down 銀染檢測及RIP驗證Lnc-DC與STAT3互作

案例二

題目：The long noncoding RNA THRIL regulates TNFα expression through its interaction with hnRNPL

小結：先用Linc1992全長進行RNA pull-down實驗，通過WB檢測手段分析四個意向蛋白中篩選得到一個差異蛋白α-hnRNPL，通過分段RNA pull-down及WB分析核心結合區域，主要是Linc1992的1-699和1406-2012區域，通過RIP-qPCR反向驗證，證明α-hnRNPL蛋白可以與Linc1992結合。

Linc1992 pull down-WB篩選差異蛋白同時結合RIP驗證Linc1992與α-hnRNPL 互作

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