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Nature重磅| 四川大學華西醫院生物治療國家重點實驗室重組蛋白新冠疫苗研究獲進展

信息來源：金開瑞作者：genecreate 發布時間：2020-08-03 11:30:56

（圖片來源于https://voice.baidu.com/act/newpneumonia/newpneumonia/?from=osari_pc_3）

由于新病例的迅速增加，2019年冠狀病毒（SARS-CoV-2）很快引起了全球關注。根據新型冠狀病毒肺炎疫情實時大數據報告，截至7月31日18時，全國累計報告確診病例88077例，現有確診病例2195例，境外輸入2063例；海外現有確診病例5867747例。這些數字每天都會更新，而且預計可能還會進一步增加。迫切需要一種有效的預防該病毒的疫苗。

2020年7月29日，四川大學華西醫院生物治療國家重點實驗室博士生導師魏霞蔚、逯光文和澳門科技大學醫學院教授張康共同通訊在Nature 在線發表題為“Avaccine targeting the RBD of the S protein of SARS-CoV-2 induces protective immunity”的研究論文，這也是Nature雜志發表的第一篇新冠疫苗研究論文。該研究通過質譜分析（并使用GPSeeker軟件分析完整的N-糖肽和聚糖）、表面等離振子共振、肺部組織的病理學分析等研究技術發現了SARS-CoV-2疫苗設計中S蛋白中RBD結構域的重要性，并為通過誘導針對RBD結構域的抗體開發保護性疫苗提供了依據。

下面我們一起來詳細解讀下這篇研究論文。

（圖片來源于https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32726802/）

一、背景介紹

SARS-CoV-2是2019年在人體中發現的冠狀病毒新毒株，到如今仍然在全球肆虐，給人們的健康以及全球的經濟發展造成了災難性的影響。如何治療和預防這種疾病，成為了全世界最關心的事情之一。開發一種可行的疫苗，變得非常有必要，也是事在必行的事情。目前全球有很多醫療公司、科研院所都在致力于新型冠狀病毒疫苗的研發。

前面已經有大量的文章報道，新型冠狀病毒感染過程中的關鍵步驟是：SARS-CoV-2利用其S蛋白的受體結合域(S-RBD）與宿主細胞受體血管緊張素轉換酶(ACE2)發生作用，從而侵染宿主細胞。

基于前面的研究和對病毒包膜蛋白的了解，作者假設受體結合域（RBD）是一種良好的免疫原，并可以觸發有效的功能性抗體反應，從而在體外中和SARS-CoV-2。在這篇文章中作者用S-RBD的319-545殘基組成的疫苗，在動物體內有很好的免疫應答，其產生的抗體在體外能阻斷RBD與細胞表面表達的ACE2結合，并中和了SARS-CoV-2假病毒和SARS-CoV-2活病毒的感染。這些發現凸顯了RBD結構域在SARS-CoV-2疫苗設計中的重要性，并為通過誘導針對RBD結構域的抗體開發保護性疫苗提供了依據。

二、RBD蛋白表達及相關研究

1、使用昆蟲細胞和Bac-to-Bac 桿狀病毒表達系統制備SARS-CoV-2刺突蛋白的重組受體結合結構域（RBD）。

2、從培養上清液中純化重組RBD蛋白，其純度超過98％（圖1b）。SDS-PAGE顯示純化的RBD蛋白的表觀分子量為34 kDa，比理論上的RBD氨基酸序列的分子量（約27 kDa）大約1/4，由于刺突蛋白是糖蛋白，故作者認為RBD區域可能存在密集的蛋白糖基化修飾。

3、通過質譜（MS），使用GPSeeker軟件分析完整的N-糖肽和聚糖。在天冬酰胺上鑒定出三個N-糖基化位點（圖1c），其中N331和N343兩個位點已有文獻報道；此外，還使用SEQUEST分析MS結果，來評估O-糖基化位點，總共鑒定出十個O-糖基化位點。

4、將這些鑒定出的糖基化位點進一步定位在與ACE2結合的SARS-CoV-2 RBD的結構上。結果表明大多數糖基化修飾位點位于RBD核心子域上，且所有位點都遠離結合的ACE2（圖1e），這表明修飾的聚糖可能不會干擾RBD蛋白與受體的識別與結合。

5、作者進一步通過表面等離振子共振技術驗證了重組RBD蛋白與ACE2的親和性，結果表明RBD以高親和力與ACE2結合，這很好地反映出了重組RBD蛋白有天然構象。

三、RBD蛋白免疫動物獲取抗血清并體外驗證重組表達抗體的效果

1、采用明礬作為佐劑，用不同的免疫劑量（0.1至20μg）和免疫方案免疫小鼠。并采用ELISA技術檢測評估重組RBD誘導的體液免疫反應效果。

2、接種后第7天獲得的血清已經顯示出對重組RBD的IgG和IgM應答升高（圖2a）。相反，來自免疫前的血清以及來自PBS和Alum免疫作為對照的血清僅具有背景水平的抗體反應。血清的抗體水平，隨著免疫的RBD蛋白劑量增加而增加，兩者在一定范圍類存在劑量依賴（圖b）

3、然后作者用SARS-CoV-2假病毒去測試血清抗體活性，同樣得到較好的結果。接著作者選取了20位健康和16位COVID-19患者的血清檢測重組RBD免疫得到的IgG和IgM，也顯示出RBD重組抗體對病毒RBD蛋白的高響應和親和性（圖e）。

四、進一步測試抗血清對RBD與ACE2結合的阻斷作用

1、在添加或不添加免疫血清的Huh7細胞培養體系中，以1：5的稀釋度將重組SARS-CoV-2 RBD-Fc融合蛋白添加到ACE2陽性的Huh7細胞，發現免疫后的血清能大大減少RBD-ACE2陽性細胞的比率，抑制RBD與ACE2的結合。

2、然后偽病毒中和實驗，在添加獼猴免疫血清的293T ACE2陽性細胞中，免疫血清可以完全阻止SARS-CoV-2假病毒的與細胞的結合。

3、接下來，測試了接種RBD免疫血清（疫苗）的非人類靈長類動物是否可以阻斷活SARS-CoV-2的感染。研究發現，當接種RBD疫苗后，在對動物的肺組織、咽拭子、肛門拭子的檢測中，都未檢測到或者檢測到較低水平的病毒基因組RNA（gRNA）和病毒亞基因組RNA（sgRNA，指示病毒復制），而對照組（未接種RBD疫苗）檢測到比較高含量的gRNA和sgRNA。此外，通過對不同接種量的比較，研究者還發現，當接種疫苗量提高時，其檢測到的gRNA和sgRNA量會減少。

4、對肺部組織的病理學分析也表明，未接種RBD疫苗的肺組織出現明顯的COVID-19癥狀，而接種RBD疫苗的肺組織則沒有顯現出明顯的病理學變化。

綜上所述，作者發現重組RBD蛋白具有良好的體液反應效果，像Alum這樣的簡單疫苗佐劑可以進一步增強免疫反應，其血清抗體與ACE2有共同結合表位；RBD疫苗具有很強的病毒中和活性，可以保護非人類靈長類動物免受SARS-CoV-2活病毒的攻擊；在非人類靈長類動物中的毒理學研究表明，該候選疫苗是安全的。另外，這種重組RBD疫苗方法在技術上和商業上都是能大規模生產和制造的。

所有這些特征都支持該候選疫苗的在進一步開發方面具有極好的前景。總之，作者的發現突出了SARS-CoV-2疫苗設計中S蛋白中RBD結構域的重要性，并為通過誘導針對RBD結構域的抗體開發保護性疫苗提供了依據。

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金開瑞糖基化修飾鑒定

糖基化是在酶的控制下在蛋白質或脂質上附加糖類的過程，起始于內質網，結束于高爾基體。在糖基轉移酶作用下將糖轉移至蛋白質，和蛋白質上的氨基酸殘基形成糖苷鍵，并在糖基轉移酶和糖苷酶的剪切、加工下形成各種類型的糖鏈。

糖基化蛋白質組學的核心任務是利用組學的手段，從全局上去尋找發生糖基化修飾的位點，解析糖鏈的結構，鑒定完整的糖肽，探索糖蛋白在生命活動中扮演的角色和生物學功能。

基于GPSeeker軟件的糖基化修飾鑒定

（圖片引自Site- and Structure-Specifific QuantitativeN-Glycoproteomics UsingRPLC-pentaHILIC Separationand the Intact N-Glycopeptide SearchEngine GPSeeker）

優勢小結

基于GPSeeker軟件的糖基化修飾鑒定

1、除了能夠確定蛋白發生糖基化修飾的位點外，還能依賴開發的”GPSeeker”搜庫軟件對該位點發生糖基化修飾的糖鏈結構進行分析；

2、能知道發生糖基化修飾位點上的完整糖鏈信息；

3、基于完整N-糖肽液-質聯用分析特征所發展穩定同位素標記可實現疾病差異表達糖基化的相對和絕對定量。

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