一、研究背景

 

 

弓形蟲是食源性疾病的主要原因，食用未煮熟的豬肉是感染弓形蟲病的主要危險因素，給社會造成沉重負(fù)擔(dān)。

在本研究中，作者使用定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法來研究弓形蟲感染對豬多種組織蛋白質(zhì)組的影響。采用串聯(lián)質(zhì)譜法，全面了解蛋白質(zhì)組的功能和調(diào)控。進(jìn)行了生物信息學(xué)分析以鑒定差異表達(dá)蛋白（DEP），該蛋白可以在弓形蟲感染的病理生理學(xué)中發(fā)揮作用。另外，選擇七個DEP用于平行反應(yīng)監(jiān)測（PRM）分析，以驗(yàn)證通過質(zhì)譜分析獲得的表達(dá)結(jié)果。

二、技術(shù)路線

 

 

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

 

 

1. 弓形蟲感染的確認(rèn)

感染組中的所有豬在6 dpi（days post infection [dpi]）時都表現(xiàn)出臨床體征，例如發(fā)燒和食欲不振，而對照組中的豬顯然仍然健康。PCR結(jié)果顯示，感染組的所有收集組織均為弓形蟲B1基因陽性。而對照組的組織是B1基因陰性的。

2. 感染組織的蛋白質(zhì)組學(xué)特征

iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)在豬腦（大腦皮層），肝，肺，腸系膜淋巴結(jié)（MLN）和脾臟中分別鑒定了4706、4224、4535、5103和4414個蛋白。在6 dpi時，受感染的腦，肝，肺，MLN和脾臟中的DEPs分別上調(diào)了108、125、109、163和140，下調(diào)了48、266、61、129和60。在18 dpi時，受感染的腦，肝，肺，MLN和脾臟中的DEPs分別上調(diào)了202、171、233、159和141，下調(diào)了137、180、250、229和162 （圖1A）。在所檢查的組織組中未發(fā)現(xiàn)常見的DEP。為了驗(yàn)證表達(dá)數(shù)據(jù)，使用PRM進(jìn)行了靶向質(zhì)譜分析。脾臟和MLN的七個選定蛋白（HSP90AA1，OXCT1，ARL6IP5，GBP7，GBP1，PDIA3和GVIN2）的PRM表達(dá)數(shù)據(jù)顯示與基于iTRAQ的質(zhì)譜數(shù)據(jù)相似的表達(dá)趨勢，從而證明了蛋白表達(dá)數(shù)據(jù)的有效性（圖2）。

圖1 差異表達(dá)蛋白質(zhì)（DEP）以及蛋白質(zhì)表達(dá)譜的共表達(dá)分析

圖2  iTRAQ與PRM定量比較

3. 差異表達(dá)蛋白質(zhì)（DEP）的GO和KEGG通路

GO和KEGG對DEP的分析表明，大多數(shù)感染組織（包括腦，脾，肺和MLN）的囊泡相關(guān)過程均被上調(diào)。然而大約190個參與代謝過程的蛋白質(zhì)在受感染的肝臟中差異表達(dá)，其中大多數(shù)被下調(diào)。這表明弓形蟲感染期間肝臟中存在新陳代謝的下調(diào)。在所有受感染的組織中，免疫或感染相關(guān)途徑均被上調(diào)。這表明抗弓形蟲的機(jī)制被激活，其中一些機(jī)制在不同組織之間可能很常見，并且對于幫助豬宿主體內(nèi)抵抗弓形蟲很重要。

4. 共表達(dá)和性狀相關(guān)分析

共表達(dá)和性狀相關(guān)分析可以揭示可能有助于抵抗弓形蟲感染的常見宿主途徑。如圖所示圖1B，被感染組織的蛋白質(zhì)譜與未感染組織不同，表明被弓形蟲感染已改變了被感染組織的生物學(xué)反應(yīng)。根據(jù)蛋白質(zhì)譜簇樹狀圖，發(fā)現(xiàn)了25個蛋白質(zhì)共表達(dá)模塊（圖1C）。模塊，性狀和弓形蟲基因顯著性關(guān)系顯示在圖3A，B，我們發(fā)現(xiàn)粉紅色模塊與弓形蟲的感染相關(guān)性最高。如圖所示3C，對于弓形蟲感染，基因模塊成員與重要基因之間的全局相關(guān)系數(shù)為0.6，p值為8.1×10 -31。這些數(shù)據(jù)表明粉紅色模塊中的蛋白質(zhì)與弓形蟲感染有關(guān)。粉紅色模塊包含301種蛋白質(zhì)。表現(xiàn)出對弓形蟲感染最重要的最高基因的前30種蛋白質(zhì)包括：HSP90AA1，PLCH1，SERPINA3-3，HSPA4，GBP1，HSPCB，STIP1，TRIM21，HYOU1，HSPA5，ITGAL，PZP，GVIN1，PDIA3，ERAP1，C3， SLA-DRA，LOC100513619，C4，GP91-PHOX，HSPH1，PLG，GBP7，STAT3，CASP1，HSP90B1，HSPA8，PPIB，TAP1和HSP70.2。前30個基因的相互作用網(wǎng)絡(luò)顯示在圖3D，如所有這些基因的AUC所示，所有排名前30位的基因均表現(xiàn)出出色的預(yù)測弓形蟲感染的能力（圖4）。對粉紅色模塊中基因的KEGG富集分析表明，69條途徑顯著富集（圖5）。

圖3 模塊和弓形蟲感染之間的關(guān)系

圖4 ROC分析和AUC

圖5粉紅色模塊中基因KEGG富集分析

5. 潛在抗豬弓形蟲蛋白的鑒定和功能分析

粉色模塊與弓形蟲的感染高度相關(guān)?？梢灶A(yù)見的是，具有抗弓形蟲特性的基因應(yīng)該與弓形蟲的感染高度相關(guān)，并在受感染的組織中上調(diào)。如圖6A所示，粉紅色模塊中的蛋白質(zhì)分為上調(diào)和下調(diào)。我們進(jìn)一步分析了基因在上調(diào)和下調(diào)分支中的功能。如圖7所示，下調(diào)分支的基因在代謝，細(xì)胞遷移或相互作用中顯著豐富。但是，上調(diào)分支的基因在免疫或感染相關(guān)途徑中顯著富集。因此，上調(diào)的分支中的基因被認(rèn)為是PATP。通過分析豬基因組上的基因分布，我們確定了豬染色體7中的兩個PATP熱點(diǎn)。分布在這兩個熱點(diǎn)中的大多數(shù)基因都參與了抗原呈遞或其他與免疫反應(yīng)相關(guān)的途徑。

為了確定已鑒定的PATP的功能，使用CRISPR-Cas9方法構(gòu)建過表達(dá)PDIA3-和HSP70.2的細(xì)胞系。我們選擇了兩個高表達(dá)的PATP（PDIA3和HSP70.2），它們是前30種蛋白質(zhì)的中樞蛋白質(zhì)，用于構(gòu)建過表達(dá)的細(xì)胞系。我們的PCR和DNA測序結(jié)果表明，PDIA3和HSP70.2過表達(dá)已正確插入H11位點(diǎn)（圖6C），盡管僅將HSP70.2插入一個H11等位基因。Western印跡分析表明，HA標(biāo)記的PDIA3和HSP70.2在兩種過表達(dá)的細(xì)胞系中正確表達(dá)（圖6D）。HSP70.2和PDIA3是抗原呈遞途徑中的兩個關(guān)鍵蛋白，并促進(jìn)由MHC-1復(fù)合物呈遞的抗原。如所預(yù)期的，與野生型3D4 / 2巨噬細(xì)胞相比，HSP70.2和PDIA3過表達(dá)的細(xì)胞系顯示較低的弓形蟲載量，尤其是PDIA3過表達(dá)的細(xì)胞。我們的研究還表明，HSP70.2和PDIA3可以達(dá)到弓形蟲（圖8），表明HSP70.2和PDIA3可能促進(jìn)弓形蟲的抗原呈遞，從而有助于限制弓形蟲在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制。除了HSP70.2和PDIA3，我們還鑒定了許多其他蛋白，這些蛋白可能具有抗弓形蟲的特性，并且可以揭示體內(nèi)針對弓形蟲感染的宿主應(yīng)答新機(jī)制。

圖6 粉紅色模塊中的基因和潛在的抗弓形蟲蛋白（PATP）聚集

圖7 對粉紅色模塊兩個分支中的基因進(jìn)行KEGG富集分析

圖8 與對照（野生型）細(xì)胞相比，穩(wěn)定過表達(dá)（OE）HSP70.2和PDIA3基因的轉(zhuǎn)基因3D4 / 2細(xì)胞的免疫熒光分析

四、小結(jié)

 

 

用iTRAQ技術(shù)研究了弓形蟲感染過程中豬腦，肝，肺，脾和MLNs的蛋白表達(dá)譜。蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示每個受感染組織中的DEP均大于100。免疫反應(yīng)在所有受感染的組織中均活躍，而在受感染的肝臟中檢測到新陳代謝過程下調(diào)，而在受感染的大腦中囊泡介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)上調(diào)。使用性狀相關(guān)分析，我們確定了25個共表達(dá)模塊和許多PATP。我們還證明了過表達(dá)兩個PATP（HSP70.2和PDIA3）的豬巨噬細(xì)胞顯示出對弓形蟲感染的抵抗力增強(qiáng)。進(jìn)一步闡明本研究中確定的其他PATP的功能將增進(jìn)我們對豬抵抗弓形蟲感染的了解。最終，這項(xiàng)工作可以為抗病豬的發(fā)展提供堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，從而可以減少養(yǎng)豬場中抗寄生蟲藥物的使用。