客戶文獻分享| IF=14.612，基于酶催化的Asp-Phe-Tyr三肽聚合反應癌癥免疫療
信息來源：金開瑞 作者：genecreate 發布時間：2021-05-17 15:48:02
本期解讀
題目：A Strategy Based on the Enzyme-Catalyzed Polymerization Reaction of Asp-Phe-Tyr Tripeptide for Cancer Immunotherapy期刊：JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY
影響因子：14.612/Q1
合作技術：iTRAQ定量蛋白組學
一、研究背景
釋放免疫系統的力量被認為是治療癌癥的重要策略。盡管大多數癌癥都表達腫瘤特異性抗原，但免疫療法仍是保守的，反應低且不良反應頻繁。一個主要原因是癌癥已經獲得了抑制抗原呈遞的能力。約70-95％的人類癌細胞下調與抗原呈遞相關的蛋白質的表達。這些蛋白質的系統性缺乏促使癌細胞逃脫免疫識別。激活免疫系統的努力主要集中在使用拮抗劑或抑制劑靶向某些蛋白質上。但是，單靶標藥物的功效是有限的，而免疫療法為癌癥提供了一個有前景的治療策略。然而，即使在高抗原負擔的腫瘤中，全身抑制抗原提呈仍然極大地限制了免疫治療的應用。在此，研究者構建了一種基于功能三肽Asp-Phe-Tyr (DFY)的腫瘤蛋白工程系統，該系統可以自動收集和傳遞靶向細胞的免疫腫瘤蛋白到免疫細胞中。通過酪氨酸酶催化聚合，DFY三肽選擇性地聚集在酪氨酸酶高表達的黑色素瘤細胞中。然后將富含醌的中間體與腫瘤特異性蛋白通過Michael加成共價連接，形成攜帶腫瘤蛋白的微纖維，該微纖維可被抗原提呈細胞吞噬，并表現出腫瘤抗原特性以增強免疫效果。在抗原遞呈不足的黑色素瘤細胞中，該系統可以成功地富集和運輸含有腫瘤抗原的蛋白質到免疫細胞。此外，在小鼠黑色素瘤的體內研究中，DFY三肽經皮傳遞抑制腫瘤生長和術后復發。
二、技術路線
聚合肽篩選鑒定——聚合肽DFY作用機制解析——DFY作用下功能蛋白差異性分析——腫瘤蛋白交聯pDFY的免疫激活機制解析——腫瘤模型DFY抗癌作用驗證
三、實驗結果
1. 酪氨酸酶催化聚合DFY。
首先，研究者篩選得到一種可被酪氨酸酶催化聚合的肽DFY（Asp-Phe-Tyr），并觀察到在聚合過程中產生了不溶性黑色沉淀物，利用倒置顯微鏡和掃描電子顯微鏡（SEM）觀察均表明是由DFY聚合成的微纖維（圖1b和圖1b）。然后，研究者研究了各種細胞系中酪氨酸酶基因（TYR）表達的差異，基于CCLE數據庫（https://portals.broadinstitute.org/ccle）分析了TYR基因在740個細胞系中的表達水平，結果表明，與其他癌細胞分型相比，黑色素瘤細胞系表現出最高的TYR基因表達量（圖1e）。此外，研究了酪氨酸酶過表達的黑色素瘤細胞中DFY的胞內聚合反應（圖1f），結果表明DFY在黑素瘤細胞中的聚合是酪氨酸酶依賴性的。此外，研究者驗證了DFY的聚合是否可以在體內原位誘導。將DFY和不可聚合肽（Asp-Phe-Phe，DFF）注射到小鼠癌旁組織中以觀察其在腫瘤中的清除情況。如圖1i所示，注射的DFY比DFF在腫瘤位置停留的時間更長，相比之下，大多數DFF在腫瘤中被快速清除了，因此推測DFY能在腫瘤組織中特異性聚合。
2. DFY的胞內蛋白捕獲。
研究者通過MTT分析表明，DFY在33μM的濃度下可抑制小鼠B16細胞的增殖達57％（圖2e），在與各種B16細胞抑制劑孵育后，發現單苯甲酮（酪氨酸酶抑制劑）和谷胱甘肽（GSH）均可將B16細胞從DFY聚合引起的細胞死亡過程中拯救出來（圖2f）。Ac-DEVD-CHO（凋亡抑制劑），ferrostatin-1（促肥大癥抑制劑），necrostatin-1（壞死性抑制劑），TBHQ和BHA（醌氧化還原酶誘導劑）卻無法挽救DFY對細胞的傷害。得出的結論是，單苯甲酮和谷胱甘肽的解毒作用歸因于GSH和DFY之間的邁克爾加成。通過熒光顯微鏡觀察，發現長期培養后，微纖維從細胞中釋放出來（圖4Sd，e）。實驗證明DFY收集靶細胞的胞內蛋白，并以類似于壞死的方式將它們轉運出細胞，并伴隨DFY聚合誘導的細胞死亡。因此，由pDFY攜帶的腫瘤蛋白的釋放可能刺激隨后的抗原觸發的免疫反應。
3. 交聯蛋白的蛋白質組學研究。
由于蛋白質的免疫原性因蛋白質而異，研究者研究了通過抗原工程系統收集的蛋白質類型，與金開瑞合作的串聯質譜用于定量分析蛋白質含量。如圖3a，b和S5所示，在DFY聚合后，確定了190個上調蛋白和346個下調蛋白（倍數變化1.5和P <0.05，超幾何測試）。然后通過GO數據庫富集分析了這些差異蛋白的功能。結果表明，這些蛋白質大多數與細胞代謝（氨基酸代謝，糖代謝），能量供應（糖酵解，有氧呼吸）和蛋白質合成（核糖體）相關（圖3c）。發現這些蛋白質在功能上涵蓋了細胞最重要的生物學功能（圖3d）。差異蛋白主要來自核糖體，線粒體，細胞核和高爾基體。此外，通過STRING功能蛋白締合網絡研究了DFY聚合后減少的蛋白質之間的相互作用（圖3e）。來自細胞器的蛋白質，特別是核糖體，線粒體和細胞核中的蛋白質，形成緊密的簇。該結果表明DFY可以特異性地交聯來自這些細胞器的蛋白質，從而導致這些蛋白質的顯著減少。另外，作為專業的產生黑色素的細胞器，還分析了在DFY處理的黑色素瘤細胞中黑色素體的蛋白質表達（圖S5）。GO富集分析的結果表明，用DFY處理后，黑素體中的大多數相關蛋白也被下調。使用主成分分析（PCA）分析了Cys含量，理論等電點和差異蛋白質脂肪族指數三個指標（圖3f），該結果表明被下調的蛋白質可以被DFY結構結合或化學交聯。從實驗上觀察到，DFY處理可抑制線粒體功能，抑制蛋白質合成并損害細胞骨架形成（圖S6）。這些實驗結果與理論推測吻合良好。
4. 腫瘤蛋白交聯pDFY的免疫激活。
為了研究B16細胞釋放的纖維是否可以被APC吞噬，通過共聚焦熒光顯微鏡和流式細胞術檢查了B16和APC（RAW264.7和DC）對DFY或pDFY的攝取（圖4a，b）。熒光成像表明DFY在各種細胞中積累，但pDFY傾向于被APC吞噬。該觀察證明，纖維攜帶的抗原蛋白更傾向于遞送至APC。為了闡明pDFY攜帶的腫瘤蛋白是否能增強免疫反應，用流式細胞儀進一步分析了裂解物蛋白交聯的pDFY在DCs成熟中的能力（圖4c）。與裂解物組相比，裂解物+ pDFY在DC的成熟度上增加了2.3倍。此外，與裂解物+ pDFY相比，裂解物@pDFY誘導的DC成熟也更為顯著（P = 0.0002）。然后將B16蛋白交聯的經pDFY處理的B16細胞和脾細胞以1:10的比例共孵育，以研究智能抗原工程系統引發針對癌細胞的特異性免疫反應的能力（圖4d），研究發現經裂解物@pDFY處理的脾細胞消除了59.3％的B16細胞。相反，裂解物或裂解物+ pDFY處理的脾細胞的混合物僅殺死了不到30％的B16細胞。攜帶腫瘤抗原蛋白的裂解物@ pDFY成功觸發了針對B16細胞的特異性免疫殺傷。在此基礎上，考慮到pDFY的佐劑作用和交聯蛋白的強免疫原性，抗原工程系統可作為黑色素瘤治療的免疫增強疫苗型材料。最后，經B16荷瘤小鼠皮下藥物注射研究，證明了由于某些功能蛋白被裂解物@ pDFY富集，裂解物@ pDFY可以成功激活體內抗癌免疫反應。
5. DFY在不可切除黑色素瘤中的抗癌作用。
隨后，研究者對抗原工程系統的腫瘤抑制能力進行了分析。抗PD1抗體（aPD1）或化學治療藥物已與基于DFY的抗原工程系統結合用于治療B16荷瘤小鼠（圖5a）實驗結果表明DFY + aPD1的治療抑制了91％的腫瘤生長。研究者還記錄了各種治療后小鼠的存活率（圖5c）。在所有組中，用DFY + aPD1處理的小鼠的存活時間最長。該結果表明，腫瘤周圍注射DFY不僅可以收集可能含有腫瘤抗原的腫瘤蛋白，而且可以將免疫原性腫瘤蛋白遞送至APC并引起隨后的CTL激活以抑制腫瘤進展。酶聯免疫吸附試驗（ELISA）顯示，DFY + aPD1處理后，包括干擾素γ（IFN-γ）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）在內的免疫激活標記物增加（圖5f）。
6. DFY經皮給藥治療黑色素瘤。
研究者將凝膠狀的DFY @ gel作為一種透皮治療系統，粘附在皮膚上時釋放DFY。如圖6g所示，在相同深度下，用DFY @ gel治療的腫瘤的平均熒光強度（MFI）高于DFY。使用V-C擴散池和熒光光譜儀研究了分離的豬皮中DFY @ gel的透皮吸收。與游離DFY相比，DFY @ gel的透皮滲透提高了1.5倍（圖6h）。然后通過測量腫瘤體積評估DFY @ gel抑制腫瘤生長的能力（圖6i）。在為期16天的實驗中，DFY @ gel顯示出與DFY（腹膜內注射）相似的治療效果。IFN-α在臨床上用于術后黑色素瘤的治療。與臨床方案相比，評估了DFY @ gel的治療效果。IFN-α和經皮凝膠治療均顯著抑制了腫瘤的復發。該結果表明透皮DFY @ gel在預防黑素瘤復發方面具有與臨床上使用的IFN-α幾乎相同的治療效果。
四、小結
在這項研究中，研究者設計了一種基于肽的腫瘤蛋白工程系統，該系統對黑素瘤治療表現出強大的免疫原性。一旦進入惡性黑色素瘤細胞，該三肽進行酪氨酸酶催化的氧化聚合。同時，通過邁克爾加成反應還捕獲了來自細胞核，線粒體和核糖體的高免疫原性功能蛋白，這引起了類似于壞死的快速細胞死亡。隨后，腫瘤蛋白交聯的pDFY從垂死和破裂的癌細胞中釋放出來，形成的聚集纖維更易于被APC內吞。因此，設計的腫瘤蛋白質工程系統成功地收集了免疫原性蛋白質并將其遞送至APC，并表現出輔助作用以增強免疫應答以消除腫瘤。DFY的經皮免疫療法在小鼠和小型豬模型中也顯示出高效率和高生物相容性，并顯著延長了腫瘤小鼠的存活時間。在可切除的黑色素瘤中，發現DFY@gel具有與臨床IFN-α治療相似的復發預防效果。
了解金開瑞iTRAQ定量蛋白質組學技術：http://cc-9.com/iTRAQ/
最新動態
-
09.23
中藥的現代詮釋：外泌體如何革新傳統醫學？
-
07.02
1+1＞2！深度解析RNA測序數據挖掘邏輯和后期實驗設計思路，輕松研獲10+ SCI
-
07.01
“稻”亦有道——盤點近期水稻研究的重大突破
-
06.28
科學與美學的結合體：植物亞細胞定位技術詳解
-
06.28
“聚焦新質生產力，激發科研新動能”|LCA躋身蛋白互作研究的新銳力量
-
06.05
知無不“研”|一文讀懂免疫共沉淀技術（Co-IP）
-
05.14
四大研究利器(Co-IP、BIFC、Y2H、GST pull-down)助力速配蛋白互作“最佳拍檔”
-
05.14
高效、精準、直觀、實時——取經“蛋白互作研究翹楚”BIFC！
-
05.14
轉染效率低、干擾效果差、重復性欠佳...siRNA研究頻遇“攔路虎”怎么辦？
-
04.22
一文讀懂EMSA技術核心要點，讓“emsa” 秒變“easy”
X 
