分子互作是生命體的普遍主題，分子互作技術作為生命科學的基礎技術現已廣泛應用于生命科學研究的方方面面。本文是分子互作專欄的第四篇文章，主題是“蛋白-DNA互作專題之酵母單雜交”。

  酵母單雜交-原理  

    酵母單雜交是在酵母雙雜交基礎上發展而來的一種體外研究DNA和蛋白質相互作用的技術，已經被廣泛應用于科學研究的各個領域。

    其理論基礎是許多真核生物的轉錄激活因子均具有兩個功能上獨立的結構域——DNA結合結構域和激活結構域，前者特異結合于順式作用元件上，后者實施基因表達調控功能，單獨的結合結構域或者轉錄激活結構域都不能啟動下游報告基因的表達，酵母單雜交技術就是利用此原理構建各種基因與轉錄激活結構域所融合的蛋白，只要轉錄激活域所融合的蛋白能與特異的DNA序列結合。

    也就是說它能扮演轉錄因子結合結構域的功能，那么就會形成有功能的轉錄因子，從而實施基因表達調控，激活啟動子下游報告基因的表達，人們基于酵母單雜交系統的酵母GAL蛋白即是一種典型的轉錄因子[1]。

原理示意圖如下：

圖片[2]:Cartoon illustrating the basic components of a Y1H assay.

  實驗步驟  

    基因合成——誘餌、獵物重組質粒構建——誘餌自激活及毒性驗證——雜交驗證（酵母細胞共轉化）——稀釋點種驗證（更多詳細信息請咨詢客服領取相關資料哦！）

  應用范圍  

轉錄因子研究

    酵母單雜交可用于研究轉錄因子與DNA序列的特異性結合。通過構建誘餌包含啟動子或增強子序列，并與獵物中的轉錄因子相互作用，可以鑒定和驗證轉錄因子-基因調控序列的相互作用關系。

DNA結合蛋白鑒定

    酵母單雜交可用于鑒定與特定DNA序列相互作用的蛋白質。通過構建誘餌包含DNA結合序列，與獵物中的蛋白質相互作用，可以篩選和驗證與該DNA序列特異性結合的蛋白質。

蛋白質相互作用網絡

    通過酵母單雜交技術可以篩選和鑒定蛋白質間的相互作用關系，從而構建蛋白質相互作用網絡。這有助于了解細胞內蛋白質相互作用的調控機制、信號傳導途徑和細胞過程的調節。

疾病相關蛋白質研究

    酵母單雜交可用于研究與疾病相關的蛋白質相互作用。通過構建誘餌包含疾病相關基因的序列，與獵物中的蛋白質相互作用，可以鑒定潛在的疾病相關蛋白質相互作用伙伴。

藥物篩選和靶點鑒定

    酵母單雜交可用于篩選和鑒定與小分子化合物相互作用的蛋白質。通過將小分子化合物作為誘餌，與獵物中的蛋白質相互作用，可以評估潛在藥物的靶點和相互作用機制。

常見問題與解析

如果誘餌可以直接激活報告基因，該如何處理?

    為保證誘餌蛋白功能的完整性，首先我們會考慮用3'AT/ABA進行背景抑制，但是由于這兩種試劑對酵母生長具有較大的毒性，后續可能會影響文庫篩選，因此在3'AT超過15mM,ABA超過1200ng/ml時我們會考慮將誘餌蛋白進行截斷，通過查閱文獻和相關數據庫，截去轉錄激活的區域，需要注意的是，截去的這一部分很有可能會影響到互作結果。

酵母雜交發生假陽性的原因及解決方式

產生原因

    (1)由于BD融合誘餌蛋白有單獨激活作用，或者其激活作用被外來蛋白激活。

    (2)AD融合靶蛋白如果有DNA的特異性結合，也可以單獨激活報告基因的表達。

    (3)BD和AD在文庫中會有隨機碰撞導致空間上的接近，以致下游報告基因的表達。

解決方法

    (1)對于點對點驗證來說，可同時將誘餌和獵物進行自激活驗證，減少假陽性的判定，但是一旦誘餌和獵物均產生自激活，后續自激活的處理方式(截短)會浪費較多的時間；(我們一般不采取這種解決方式)

    (2)由于每個報告基因上游的調控區各不相同，因此用不同的報告基因驗證陽性，可用于排除或減少假陽性；(我們主要采用這種解決方式)

    (3)單雜啟動子，我們主要采用將報告基因整合到酵母的染色體上，可以使基因表達水平文檔，消除了由于質粒拷貝數變化引起的基因表達水平的波動而造成的假陽性。（更多詳細信息可以通過“閱讀原文”打開金開瑞官網進行了解~）
此外作為酵母單雜交的后續實驗可以用EMSA以及雙熒光素酶實驗來輔助驗證。
 

  參考文獻：

[1] 張開慧.酵母單雜交技術的原理及應用[J].寧夏農林科技, 2012(02):31-32.DOI:10.3969/j.issn.1002-204X.2012.02.016.

[2] REECE-HOYES J S,MARIAN WALHOUT A J.Yeast one-hybrid assays:a historical and technical perspective[J].Methods,2012,57(4):441-447.