RNA pull down-實驗簡介  

    RNA pull down是檢測RNA結合蛋白與其靶RNA之間相互作用的主要實驗方法之一。使?體外轉錄法標記?物素RNA探針，然后與胞漿蛋?提取液孵育，形成RNA-蛋?質復合物。該復合物可與鏈霉親和素標記的磁珠結合，從?與孵育液中的其他成分分離。復合物洗脫后，通過WB實驗檢測特定的RNA 結合蛋?是否與RNA 相互作?。若待檢測?的蛋?明確，選擇WB鑒定；若不明確，則可選擇質譜鑒定。
 

 

  應用背景  

 

    蛋?質與RNA的相互作?是許多細胞功能的核?，RBPs在轉錄后水平參與調控mRNA穩定性、LncRNA活性、應激、腫瘤發生發展、細胞凋亡等眾多生物學過程，且與諸多人類疾病密切相關。因此，對RBPs-RNAs相互作用的研究和鑒定有重要意義。
 

  原理簡介  

 

 

  實驗流程  

 

（1）目標RNA的制備及生物素標記

    目標RNA制備的一般流程包括：

    構建RNA過表達質粒：基因合成+測序驗證

    體外轉錄模板準備：設計含T7啟動子引物；PCR擴增得到轉錄模板

    體外轉錄：以PCR產物為模板，體外轉錄得到目的RNA

（2）磁珠富集RNA

（3）RNA結合蛋白孵育

（4）RNA結合蛋白洗脫，銀染質檢：SDS-PAGE電泳銀染檢測富集蛋白的情況

（5）WB或者MS檢測

（6）鑒定獵物：RNA用qPCR鑒定；已知蛋白用WB鑒定；未知蛋白用質譜鑒定
 

 

  樣品類型  

 

    細胞或組織為主

        a）RNA 序列信息或對應 ID

        b）細胞：3×10^7（細胞沉淀不少于 80μL）

        c）動物組織：0.2g

    獲取難易程度：細胞系擴大培養即可（推薦用細胞系，如果沒有細胞系，則考慮組織樣品）；其他樣品獲取難度根據實際情況去考慮即可；

    樣品量：樣品量直接影響提取蛋白的含量，最終影響富集蛋白量；

    其他物質的干擾等影響因素：在沒有細胞系的情況下，選擇組織樣品。動物組織中脂肪等物質存在影響。
 

 

  應用延伸  

    RNA pull-down除了可以研究RNA與蛋白互作，也可以研究RNA與RNA互作，可通過探針法來研究。

	體外轉錄法	探針法
原理	將誘餌RNA標記為探針，直接將獵物吸附于磁珠上	針對難以轉錄的誘餌RNA，利用探針結合誘餌RNA，間接的把獵物吸附于磁珠上
對照	antisense	無意義序列探針
應用范圍	誘餌RNA長度在300-1500bp	誘餌RNA太短或太長
優點	特異性強。體外轉錄得到的是純的誘餌RNA片段，不存在其它RNA的非特異性干擾，也不存在同源性的問題，所以特異性強，結果可靠性高。	不需要體外轉錄步驟，所以相對來說更簡單，可以適用于幾乎所有的RNA。
缺點	需要擴增得到體外轉錄RNA模版，同時要體外轉錄得到目的RNA，而DNA擴增和RNA逆轉錄都是需要比較合適的條件合適的引物才行，太長或結構問題的會導致擴增或轉錄不出來，相對探針法更困難。	由于很多RNA在細胞里面存在序列接近甚至完全包含誘餌RNA的轉錄本，所以當碰到這種情況時沒法設計探針，另外由于是間接性的釣取獵物，多了探針作為過渡，效率不一定有體外轉錄直接得到目的RNA做探針的效率高。

 

實驗常見問題

RNA結合蛋白的親和力不夠的原因？

    可能的原因：

        1）結合緩沖環境沒有優化；

        2）裂解不完全；

        3）磁珠用量不足；

        4）RNA探針用量不足。

    解決方案：

        1）優化孵育時間、溫度、鹽濃度等條件；

        2）增加裂解液和蛋白上樣量的比例；

        3）增加磁珠或探針用量；

        4）確定生物素和鏈霉親和素效率。

 

RNA結合蛋白沒有結合的原因？

    可能的原因：

        1）靶蛋白量不足；

        2）緩沖體系不對；

        3）RNA探針和蛋白的親和力本來就低。

    解決方案：

        1）增加上樣蛋白量；

        2）應用低鹽體系；

        3）加入交聯試劑。

 

WB信噪比高的原因？

    可能的原因：

        1）陽性信號率低；

        2）一抗效率低；

       3）蛋白沒有充分沽解。

    解決方案：

        1）增加一抗的量；

        2）用敏感度的化學發光液；

        3）用細胞裂解液預孵一抗；

        4）增加樣品的量；

        5）確定有沒有其他可能的結合情況；

        6）增加裂解液用量。

 

結合的非特異性高的原因？

    可能的原因：

        1）緩沖環境沒有優化；

        2）緩沖環境嚴謹性低；

        3）樣品沒有裂解完全和裂解體系沒有優化。

    解決的方案：

        1）優化孵育時間、溫度、鹽濃度等條件；

        2）使用嚴謹性高的緩沖體系；

        3）調低RNA探針和樣品的比例；

        4）提高裂解液的量。

 

做RNA pull down+質譜一般會發現多個互作蛋白，對多個蛋白，如何選擇就哪一種繼續研究下去？

    不同的RNA結合蛋白數量不等，根據實際鑒定的蛋白進行篩選；篩選的原則是根據自己研究的方向或相關功能確定這類蛋白。
 

 

  案例分享  

 

Circular RNA circEsyt2 regulates vascular smooth muscle cell remodeling via splicing regulation

期刊：J Clin Invest  IF：11.864  發表時間：2021