研究基因調控對于揭示生物體內復雜生命活動的調節機制至關重要。了解基因如何被調控，對于理解發育、疾病發生和治療等方面具有重大意義。基因調控研究依賴于多種實驗技術，其中，雙熒光素酶報告基因實驗是一項重要的工具。

    通過構建含有熒光素酶報告基因的表達載體，研究者能夠觀察基因調控因子對熒光素酶活性的影響，實現實時、定量的基因表達監測。這項技術的獨特之處在于其高度靈敏性和快速響應性，使得研究者能夠準確地探究基因的表達水平和調控機制，為新藥研發和疾病治療提供了有力支持。下面讓我們一起來深入了解這一引人注目的技術——雙熒光素酶報告基因實驗。
 

一、技術簡介

    • 雙熒光素酶檢測是轉錄調控研究中十分重要的實驗手段，主要應用于啟動子和轉錄因子，以及miRNA和其靶基因互作的驗證。

    • 在雙熒光素酶檢測中，將螢火蟲熒光素酶作為實驗報告基因，海腎熒光素酶作為對照報告基因。實驗報告基因用于測試實驗條件下基因的表達，而對照報告基因作為內對照。

    • 以熒光素為底物來檢測螢火蟲熒光素酶活性，熒光素酶可以催化熒光素，在熒光素氧化的過程中會發出生物熒光，然后通過化學發光儀測定。
 

二、原理簡介

1.轉錄因子與啟動子
 

    將啟動子序列構建到螢火蟲熒光素酶基因前，同時過表達轉錄因子。當轉錄因子與啟動子上特異結合位點結合后激活熒光素酶基因轉錄，使螢火蟲熒光素酶得以表達，最終熒光強度上升；當結合位點被突變后，轉錄因子無法與啟動子結合，因此熒光值無明顯變化。

2.miRNA與靶基因
 

    將靶基因序列構建到螢火蟲熒光素酶基因3'區域，同時過表達microRNA。當microRNA與靶基因上特異結合位點結合后，將干擾熒光素酶mRNA的翻譯或導致其迅速降解，使熒光強度降低；當結合位點被突變后，microRNA無法與靶基因結合，因此熒光值無明顯變化。

三、實驗流程

    1、確認miRNA和靶基因相關信息，或者軟件預測miRNA和靶基因結合位點

    2、基因合成靶基因3'UTR序列或者突變位點，將該片段構建到螢火蟲報告基因載體，測序驗證

    3、基因合成pre-miRNA序列，將該片段構建到CDNA3.1載體，測序驗證。或使用合成的mimic進行實驗

    4、將報告基因質粒轉錄因子與pre-miRNA表達質粒共轉染目標細胞 （建議使用293T細胞進行實驗，因為細胞種類會極大影響培養和轉染難度）

    5、裂解細胞提取蛋白并用于熒光素酶檢測

    6、加入酶作用底物，化學發光儀測定熒光素酶的活性

    7、數據計算及結果分析（實驗組熒光強度低于對照組即為陽性結果）
 

四、常見問題及解析

    問題1：在雙熒光素酶報告基因實驗中，為什么我的熒光信號弱，無法檢測到有效的結果？

    解決方案：這可能是由于底物濃度不足或酶反應時間過短所致。建議增加底物的濃度或者延長酶反應時間，確保足夠的信號被產生。

    問題2：為什么我的背景熒光信號過高，影響了實驗結果的準確性？

    解決方案：高背景信號可能是由于試劑或底物受到污染所致。請確保在實驗操作中使用無菌和純凈的試劑，并盡量避免交叉污染。此外，優化底物的濃度和酶反應時間也可以幫助降低背景信號。

    問題3：在實驗中，為什么觀察到的熒光信號不穩定，波動較大？

    解決方案：熒光信號的不穩定性可能與溫度、光照條件或儀器設置有關。請確保在實驗過程中保持恒定的溫度和光照條件，并校準實驗儀器以確保準確的信號讀數。

    問題4：我在實驗中使用的底物濃度很高，為什么熒光信號仍然不夠強？

    解決方案：熒光信號不足可能是由于底物的降解或酶的失活所致。建議檢查底物的新鮮度并避免長時間的儲存。另外，可以嘗試使用更穩定的酶或者增加酶的濃度來提高信號強度。

    問題5：在雙熒光素酶報告基因實驗中，如何避免樣本之間的批次效應？

    解決方案：為了避免批次效應，建議在實驗中使用相同批次的試劑和底物。同時，保持實驗條件的一致性，包括操作者、實驗儀器和操作步驟，也是非常重要的。定期進行質控實驗，確保數據的可靠性和穩定性。
 

五、金開瑞近期合作案例展示

發表期刊：International Journal of Nanomedicine

影響因子：8

合作技術：雙熒光素酶報告基因