特異性靶向抗菌肽（STAMPs）是新型抗生素替代品，但用于結腸感染的STAMPs開發因全新設計效率和結腸生物利用度有限而受阻。近日，浙江大學汪以真、靳明亮團隊在Science Advances發表文章，開發了一種腸道靶向納米顆?？蛇f送針對產氣莢膜梭菌感染的特異性靶向抗菌肽，為治療腸道感染的STAMPs設計和遞送提供了深入見解。

    研究團隊成功設計了高效的STAMPs，能夠物理損傷C. perfringens、消除生物膜，并自組裝成納米顆粒以封禁病原體。通過采用腸道靶向的工程顆粒疫苗（EPV）進行STAMPs的遞送，研究顯示這一策略在體內有效限制了C. perfringens感染，減輕了炎癥反應，并且在恢復擾亂的腸道微生物群方面表現出良好效果。這項研究為發現和遞送精準抗微生物藥物提供了可能的途徑。

一、研究方法與結論

1、使用遍歷設計和機器學習開發抗微生物肽（AMPs）

    這項研究通過數據庫過濾技術獲取了抗微生物肽（AMP）設計所需的基本參數信息，采用了遍歷設計策略和機器學習模型預測了AMP序列的活性水平。構建了包含1621個AMPs的數據集，通過過采樣算法平衡樣本。使用AutoGluon建立的模型中，WeightedEnsemble_L3表現最佳，ROC-AUC達到0.912。采用遍歷設計和機器學習相結合的自由體驗設計方法，成功填補了氨基酸和AMP之間的差距，提高了AMP設計成功率。六個經過篩選的肽段預測具有高抗微生物活性，其中MLamP3表現出廣譜抗微生物活性。結果表明該設計系統可行，MLamPs具有抗菌活性，MLamP1和MLamP6被篩選為HAMPs的抗菌區域，展示了不完全兩性抗菌活性和低溶血活性。結構分析揭示了MLamP1和MLamP6在不同環境中的環境響應性，為未來抗微生物療法提供了創新方法。

圖1. 遍歷設計和機器學習導出的抗微生物肽（AMP）的設計、篩選、抗微生物活性和結構

    (A)為AMPs設計的流程圖；(B)和(C)是ML模型的混淆矩陣和ROC曲線；(D)顯示了MLamPs對革蘭陽性病原體（產氣莢膜梭菌、金黃色葡萄球菌和糞腸球菌）和革蘭陰性病原體（大腸桿菌、傷寒沙門菌、鮑曼不動桿菌和志賀氏菌）的最小抑菌濃度（MIC）；(E)和(F)為MLamP1和MLamP6的螺旋輪投影；(G)和(H)為MLamP1和MLamP6的圓二色譜（CD）光譜。(I)和(J)展示了MLamP1和MLamP6的三維結構，均具有α-螺旋結構。)

2、噬菌體展示選擇特異性靶向肽

    在這項研究中，研究人員提出了一個假設，即使用抗革蘭陰性（G−）的抗微生物肽（AMPs）作為與靶向肽融合的抗菌領域，通過減法生物吸附篩選技術，可以增加C. perfringens的STAMPs的生成（圖2A）。通過使用一個包含12個隨機肽的噬菌體展示文庫進行四輪生物吸附后，約有800個噬菌體克隆被篩選并測試其與C. perfringens以及屏蔽抗原（大腸桿菌O157:H7、傷寒沙門菌ATCC 14028和志賀氏菌ATCC 12022）的親和力（圖2B）。選擇了與目標細菌具有高親和力并且對屏蔽抗原沒有或弱識別的克隆。其中，通過測序獲得了八個肽段（表S6）。由于其對C. perfringens的高親和力和特異性，選擇了F6。共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）顯示熒光異硫氰酸酯（FITC）-F6能夠與C. perfringens結合（圖2C）。通過Pull-down實驗證明了F6肽在C. perfringens中的潛在結合靶點。與對照組相比，生物素-F6拉下了13種差異蛋白質，包括12種胞漿蛋白和1種膜蛋白（圖2D和表S7）。因此，選擇了F6作為構建HAMPs的靶向肽。

圖2 生物吸附和靶向肽的篩選

    (A) 噬菌體展示技術的示意圖。(B) 四輪生物質篩選的過程。(C) CLSM圖像，顯示用FITC-F6處理的C. perfringens。(D) pull down實驗展示C. perfringens總蛋白與生物素-F6相互作用的過程。

    在上述實驗中，噬菌體展示和pull down實驗由金開瑞生物提供技術服務。

3、HAMPs的體外抗微生物活性、結構和機制

    HAMPs通過連接F6和MLamP1或MLamP6構建，對革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細菌，尤其是產氣莢膜梭菌，展現出強大的抗微生物活性。F6成功地逆轉了MLamP1和MLamP6對產氣莢膜梭菌的抗菌活性。HAMPs，如F6P1和F6P6，表現出廣譜和特異性的抗微生物特性，具有良好的生物相容性。它們保持了對環境的響應性螺旋結構，在富含葡萄糖的環境中表現出增強的效力。作用機制涉及破壞細菌細胞壁、改變膜通透性和膜去極化，導致形態損傷和細菌死亡。F6P1主要靶向細菌膜，而F6P6更傾向于破壞莢膜和細菌壁。此外，HAMPs還展現了抑制生物膜形成和清除預建生物膜的能力。

圖3. HAMPs的設計、抗微生物活性和殺菌作用

    (A)顯示了HAMPs的最小抑菌濃度（MIC），在不同培養基條件下對C. perfringens和其他細菌的影響；(B)展示了F6P1和F6P6的3D結構，均具有α螺旋結構；(C)顯示了在不同溶液條件下F6P1和F6P6的圓二色光譜（CD光譜）；(D)展示了HAMPs在不同培養基中對C. perfringens的MIC；(E)至(G)為機制測試，包括NPN、PI和DiSC3-5實驗，揭示了HAMPs對細胞壁滲透、膜通透性和膜去極化的影響；(H)通過透射電鏡（TEM）描繪了未經處理或經HAMPs處理的C. perfringens的形態變化；(I)和(J)是用2× MIC FITC-HAMPs處理的C. perfringens的熒光圖像，用額外的10μM PI進行染色，顯示HAMPs對C. perfringens的靶向和殺菌作用。

4、HAMPs的細菌聚集和自組裝

    HAMPs在最小抑菌濃度（MIC）和抗生物膜實驗中表現出細菌凝聚的現象。HAMPs能夠使懸浮細菌凝聚，自組裝成納米顆?；蚣{米網絡。這種自組裝現象在水性、陰離子膜和疏水環境中均存在，且隨著HAMPs濃度增加，抗菌活性逐漸過渡為細菌凝聚，表明它們在抗菌和凝聚之間存在平衡關系。

圖4. HAMPs的細菌聚集和自組裝

    在(A)中，HAMPs在兩種不同條件下引起了細菌的凝聚現象；圖(B)展示了HAMPs在水和疏水環境中的TEM圖像，揭示了它們在這些條件下的形態；圖(C)用示意圖展示了HAMPs的自組裝過程。

5、HAMPs在體內的生物相容性和生物分布

    通過注射F6P1或F6P6，結果表明HAMPs在小鼠體內沒有引起明顯的毒性反應，具有良好的生物相容性。生物分布研究顯示，HAMPs在腹腔注射后主要富集在腸道，表現出對腸道的高度選擇性和靶向性。

圖5. HAMPs在體內的生物相容性和生物分布

    (A至C) C57BL/6小鼠在注射HAMPs（0、10、20或30 mg/kg）后體重、相對器官重量和結腸長度的變化。結果未觀察到顯著的變化，顯示HAMPs對小鼠整體生理參數無明顯影響。(D) 注射HAMPs 5天后小鼠的腎臟和肝臟功能相關指標；結果表明HAMPs未引起肝毒性或腎毒性，生物指標在正常生理水平。(E) 注射HAMPs（30 mg/kg）5天后小鼠的肝臟、腎臟、肺部和脾臟的病理形態學分析。未觀察到組織異常，顯示HAMPs在此劑量下未引起明顯毒性作用。(F至H) 在腹腔注射FITC-HAMPs（5 mg/kg）后12小時，小鼠和器官通過體內成像系統成像；與其他器官相比，腸道顯示出強烈的信號，顯示HAMPs對腸道有選擇性和靶向性。

6、HAMPs和EPV@HAMPs的體內功效

    研究中設計了腸靶向納米粒子EPV，提高了HAMPs在結腸中的生物利用度。在食源性產氣腸球菌引起的結腸炎小鼠模型中，EPV@HAMPs通過抑制細菌生長、減輕炎癥反應和毒素水平，表現出顯著的治療效果，為治療Clostridial感染提供了潛在的策略。

圖6. 腸道靶向EPV（帶有生物素包被的納米顆粒）的特性

圖中(A)展示了EPV的直徑；(B)是通過透射電鏡觀察的EPV的形態圖像；(C)顯示了EPV在注射后2天在腸道的靶向分布。結果表明EPV的設計和制備是成功的，且它在注射后能夠在腸道中實現靶向生物分布。

7、腸道菌群的16S rRNA測序分析

    通過16S rRNA測序分析，研究發現特異性抗菌肽F6P6顯著提高小鼠腸道微生物群的豐富度和多樣性，相較于廣譜抗菌肽F6P1。EPV@F6P1的Chao1指數顯著高于F6P1，表明EPV可能減輕了F6P1對微生物群的直接影響。HAMPs和EPV@HAMPs顯著改變了慢性腸炎小鼠結腸微生物群的組成，增加了粘膜糖利用微生物和益生菌的豐度，減少了加劇腸道炎癥的有害菌。這些治療方法通過直接殺菌、增加有益菌群、提高共生菌群豐度以及減少C. perfringens的營養來源等途徑，抑制了C. perfringens的過度生長。

圖7. HAMPs和EPV@HAMPs對CPI的體內療效

    (A)CPI和治療的實驗設計。CPI小鼠被腹腔注射HAMPs，EPV@HAMPs或PBS，PBS處理組被視為對照。健康小鼠被用作酶聯免疫吸附法和免疫熒光分析的未感染對照。(B至D) 小鼠的體重、結腸長度和相對器官重量；結果顯示實驗組與對照組無顯著差異。受感染小鼠的糞便（E）和結腸組織（F)中的C. perfringens載量；結果顯示HAMPs和EPV@HAMPs顯著減少了感染小鼠糞便和結腸組織中的C. perfringens負荷，表現為對照組的97%殺滅效果。(G) 顯示小鼠結腸組織中的炎癥因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）和IL-6，對照組中顯著高于HAMPs和EPV@HAMPs處理組。(H) H&E染色和免疫熒光分析顯示，HAMPs和EPV@HAMPs處理組減輕了小鼠結腸組織中的炎癥細胞浸潤，并降低了CD86、NFκB和MPO的表達，同時增加了Ki67的表達，表明減緩了結腸炎癥跡象。

8、腸道微生物組的16S核糖體RNA測序分析

    該研究通過16S核糖體RNA測序技術分析了小鼠結腸和糞便微生物的變化，揭示了廣譜和特異性抗菌肽（AMPs）對腸道微生物組成和豐度的影響。F6P6相較于F6P1在群落豐富度和α-多樣性上表現更優，EPV@F6P1的Chao1指數顯著高于F6P1，表明EPV可能緩解了F6P1的直接影響。F6P6和EPV@F6P6顯著增加了糞便微生物群的豐富度。此外，HAMPs和EPV@HAMPs改變了CPI小鼠結腸微生物組的組成，增加了有益菌豐度，減少了加重腸道炎癥的有害菌。這些結果表明，HAMPs和EPV@HAMPs通過多種途徑有效抑制了CPI小鼠結腸中C. perfringens的寄生和過度生長。

圖8. HAMPs和EPV@HAMPs調控的腸道微生物組的16S核糖體RNA測序分析

    (A) CPI小鼠結腸（左）和糞便（右）中觀察到的操作分類單元的Chao1指數，顯示了微生物群落的α-多樣性。 (B) 顯示了不同組間腸內容物和處理組之間的β多樣性差異。(C) 展示了在門水平上不同處理組的微生物組成。(D) 在家族水平上顯著變化的微生物群的相對豐度。一些有益的菌群如Akkermansiaceae和Muribaculaceae的相對豐度增加，而一些與腸道炎癥相關的有害菌群如Clostridiaceae和Enterobacteriaceae的相對豐度減少。

9、使用F6P6和EPV@F6P6治療持續性CPI

    使用克林霉素處理的持續性CPI模型研究了F6P6和EPV@F6P6對抗抗生素誘導的CPI的療效。結果顯示F6P6和EPV@F6P6顯著降低了結腸中的細菌負荷，減輕了炎癥反應，表明它們對治療持續性CPI具有潛在療效，且EPV@F6P6可能更有利于結腸保護。

圖9. F6P6和EPV@F6P6治療持續性CPI

    (A)C. perfringens 對亞MIC濃度藥物的耐藥性發展。(B) 持續性CPI及治療的實驗設計。(C至E) 小鼠的體重、相對器官重量和結腸長度。(F至H) 感染小鼠的糞便中的C. perfringens細菌負荷 (F)、結腸內容物 (G) 和結腸組織 (H)。實驗結果顯示，EPV@F6P6顯著降低了腸道的細菌負荷，減輕了炎癥反應，并在結腸長度上表現更為保護性。

二、總結和展望

    本研究提出了一種設計和傳遞肽抗菌藥物（STAMPs）以對抗腸道病原體和難以治療的腸道感染的方法。F6P6和EPV@F6P6是治療CPI的有前途的候選藥物，因其對浮游細菌和生物膜的活性、難以產生耐藥性、對持續性CPI的療效，以及優化腸道菌群組成和靶向結腸的能力。本研究為開發能夠對抗其他病原體引起的腸道感染的STAMP提供了思路。未來工作中，通過工程細菌表達STAMPs可能在預防和治療腸道感染方面具有臨床意義。

參考文獻：
[1].Gut-targeted nanoparticles deliver specifically targeted antimicrobial peptides against Clostridium perfringens infections. SCIENCE ADVANCES, Mingliang Jin1 , Yizhen Wang1, et al. 2023.