腫瘤相關巨噬細胞（TAM）是腫瘤微環境中數量最多的免疫細胞，對腫瘤的發生發展起到重要調節作用。作者發現了一種與巨噬細胞相關的長非編碼RNA（lncRNA），名為MALR，它可以促進食管鱗狀細胞癌（ESCC）的進展。TAM通過分泌TNFa上調ESCC細胞中MALR的表達，MALR可以通過激活HIF1a信號通路促進糖酵解和血管生成。在機制上，MALR與ILF3的dsRBD1結構域結合，促進ILF3蛋白的穩定性以及由ILF3介導的液-液相分離（LLPS），從而防止PARN介導的降解，提高HIF1a mRNA的穩定性。如果MALR缺失，基于細胞系的以及患者來源的異種移植腫瘤的生長會被抑制。在臨床上，MALR的高表達與HIF1a靶基因的表達正相關，并預示著食管癌患者的預后不良。總的來說，這項研究揭示了MALR/ILF3介導的LLPS在腫瘤微環境重塑中的生理作用，突出了MALR-ILF3-HIF1a軸作為癌癥治療的潛在靶點。

  01  TAMs通過TNFa信號通路上調MALR的表達  
 

    作者首先從與TAMs共培養的ESCC細胞中分離RNA，并進行RNA-seq分析以確定TAM上調的lncRNA。通過比較與TAMs共培養的ESCC細胞和單獨培養的ESCC細胞，確定了前20個TAM上調的lncRNA（圖1A）。為了進一步縮小候選者范圍，作者對ESCC腫瘤組織與其配對的正常組織（N=20）進行了RNA-seq分析，并確定了前20個在腫瘤組織中上調的lncRNA（圖1B）。在上調的lncRNA中，只有一個候選者在兩組中均出現，這個lncRNA被命名為MALR。

    通過qRT-PCR分析，證實了MALR在ESCC組織（圖1C）以及與來自患者的TAMs、M2型巨噬細胞或THP-1細胞共培養的ESCC細胞（KYSE150和TE-11）中上調（圖1D-F）。相關性分析顯示，ESCC腫瘤組織中MALR的表達與CD68的表達呈正相關，CD68被認為是巨噬細胞的一種特異性標記（圖1G）。此外，ESCC患者中MALR高表達者總體生存率和無病生存率較差（圖1H和I），這表明MALR是ESCC潛在的預后生物標志物。此外，當與TNFa敲低的TAMs共培養或用中和抗體阻斷TNFa時，腫瘤細胞中MALR的上調沒有發生顯著變化（圖1K；補充圖S1I），這表明TNFa是導致TAMs誘導MALR表達的主要炎癥細胞因子。綜上，這些結果表明TAMs通過TNFa信號通路上調MALR的表達。

圖1. MALR通過TAMs分泌的TNFa上調

  02  MALR通過激活HIF1a通路促進ESCC細胞的惡性表型  

    考慮到MALR可能參與ESCC的惡性發展，作者在兩個高表達MALR的細胞系中（TE-15和TE-9）構建了MALR敲除（KO）的ESCC細胞，并進行了RNA-seq分析以確定受MALR調節的靶基因。熱圖結果表明，在兩種ESCC細胞系中，當MALR敲除后HIF1a的表達顯著下調（圖2A）。據報道，HIF1a在缺氧條件下調控許多基因以刺激糖酵解代謝和血管生成。對TCGA數據的基因集富集分析表明，MALR高表達與缺氧、糖酵解和血管生成呈正相關（圖2B）。qRT-PCR分析顯示，在缺氧條件下培養的MALR敲除細胞中，HIF1a靶基因的轉錄顯著減少（圖2C），這一點也得到了免疫印跡（IB）分析的證實（圖2D）。這些數據表明MALR在癌細胞中可能激活HIF1a信號通路。

    MALR的缺失顯著削弱了ESCC細胞在缺氧條件下培養時的糖酵解活性和細胞生長（圖2E和F；補充圖S2B）。VEGF是癌癥中關鍵的促血管生成因子，對癌癥進展至關重要。正如ELISA所證實的那樣，在缺氧條件下培養24小時后，MALR的缺失顯著降低了培養基中VEGF的分泌（圖2G）。此外，當人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）在從MALR敲除細胞獲得的培養基中培養時，管狀形成能力顯著受損（圖2H）。TNFa刺激顯著增強了ESCC細胞在缺氧條件下培養時的糖酵解活性、細胞生長和管狀形成能力，而這種作用可被MALR敲除所減弱（圖2I-K）。綜上所述，這些數據表明MALR表達與HIF1a激活之間存在強相關性，并強調了MALR在重編程癌細胞代謝和促進血管生成中的潛在作用。

圖2. MALR通過激活HIF1a通路促進ESCC細胞的惡性表型

03  ILF3與MALR結合并經歷LLPS  

    接下來，作者通過FISH檢測和MALR的亞細胞定位發現MALR主要定位于細胞核（圖3A和B；補充圖S3A）。為了探究MALR在腫瘤進展中的潛在作用和機制，作者進行了RNA pull-down分析，隨后通過MS鑒定了與MALR相關的蛋白質，如之前報道的那樣，特異性與ILF3結合是正義MALR，而不是反義MALR（圖3C）。MALR與ILF3之間的特異性相互作用也通過RIP實驗得到證實（圖3D；補充圖S3B）。進一步的MTRAP實驗表明，與陰性對照相比，MS2-MALR和MCP-3FLAG質粒的共表達導致ILF3的明顯富集（圖3E）。作者還通過ChIRP分析在體內驗證了MALR與ILF3的相互作用（圖3F）。

    此外，作者進行了CLIP-PCR分析，并鑒定了MALR的T3片段介導了MALR與ILF3的相互作用（圖3G）。通過進行ILF3蛋白序列的生物信息學分析，作者發現ILF3的C端高度無序，并包含IDRs（圖3H）。研究表明IDRs經常出現在相分離的隔室中，因此作者推測ILF3分子有可能發生LLPS。為了評估與MALR的相互作用是否誘導ILF3發生LLPS，作者將EGFP-ILF3蛋白（綠色）與Alexa Fluor 546-14-UTP標記的MALR（紅色）混合。混合后，ILF3和MALR形成了微米大小的液滴（圖3I），這在ESCC細胞中通過FISH和IF檢測也觀察到了（圖3J）。FRAP分析進一步證明了ILF3介導的LLPS的動力學特性（圖3K；補充影像S1）。如FRAP分析所示，液滴動態地改變，分子在液滴與周圍溶液之間進行交換（圖3K；補充影像S1）。綜上所述，這些結果表明ILF3蛋白能夠發生LLPS。

圖3. ILF3與MALR結合并經歷LLPS

  04  MALR促進ILF3蛋白的穩定性和ILF3介導的LLPS  

    隨后，作者評估了MALR-ILF3相互作用對ILF3穩定性的功能效應。作者發現在ESCC細胞與巨噬細胞共培養或用TNFa處理后，ILF3的表達增加（圖4A；補充圖S4A）。具體來說，MALR KO ESCC細胞中ILF3的表達明顯減少，但通過蛋白酶體抑制劑MG-132處理可以恢復（圖4B），這表明MALR促進ILF3的穩定性。此外，敲除MALR對ESCC細胞中ILF3的穩定性有顯著影響，縮短了ESCC細胞中ILF3的半衰期（圖4C和D；補充圖S4B）。此外，作者在用FLAG標簽標記的ILF3表達的細胞中進行了IP試驗，用抗FLAG抗體進行IP檢測，并通過IB法檢測了泛素水平。結果顯示，MALR敲除顯著增加了泛素化ILF3的水平（圖4E）。這些數據表明，MALR是維持ILF3穩定所必需的。為了找出與MALR相互作用所需的ILF3蛋白的結構域，作者測試了幾種截短的ILF3蛋白形式并發現ILF3的dsRBD1片段在TE-9細胞中是必需的（圖4F）。綜上所述，ILF3的dsRBD1片段是MALR-ILF3相互作用和包括ILF3蛋白穩定性、細胞生長在內的關鍵功能所必需的。

    之前的研究表明，SPOP是一種E3泛素連接酶，通過與dsRBD1片段附近的結構域的物理相互作用來調節ILF3蛋白的穩定性。基于這一發現，作者通過Co-IP實驗觀察到敲除MALR顯著增強了ILF3與SPOP之間的相互作用（圖4G），這一結果也得到了Duolink PLA實驗的證實（圖4H；補充圖S4H）。因此，作者的數據表明MALR通過阻止SPOP介導的泛素化來增加ILF3蛋白的穩定性。當ILF3-EGFP蛋白濃度為0.1mmol/L時，在不存在MALR的情況下觀察到了液滴的形成（圖4I）。此外，正交實驗表明ILF3的相分離依賴于MALR的劑量。在存在MALR的情況下，相同蛋白濃度下液滴形成能力顯著增強（圖4I）。為了進一步探討MALR對ILF3相分離的影響，作者在ESCC細胞中過表達MALR，發現顯著增加了ILF3點狀形成（圖4J）。MALR KO ESCC細胞中ILF3點狀形成受到抑制，這可以通過重新表達FL-MALR來挽救，而在DT3-MALR過表達組中則不是這樣（圖4K）。這些結果表明，MALR（尤其是T3片段）促進ILF3介導的LLPS形成并促進腫瘤生長。

圖4. MALR促進ILF3蛋白的穩定性和ILF3介導的LLPS

  05  MALR-ILF3介導的LLPS增加了HIF1a mRNA的穩定性  

    Actinomycin D是一種廣泛用于測量mRNA降解率的轉錄抑制劑，在ESCC細胞中，MALR的缺失降低了HIF1a mRNA的穩定性，而在這些細胞中加入Actinomycin D（圖5A；補充圖S5B）后也是如此。相反，TNFa處理顯著增強了HIF1a mRNA的穩定性，這可以通過在ESCC細胞中敲除MALR來挽救（圖5B；補充圖S5C）。此外，在MALR KO ESCC細胞中，HIF1a mRNA的穩定性降低可以通過外源性表達WT-ILF3來挽救，但不能通過DIDR-ILF3或DdsRBD1-ILF3來挽救（圖5C；補充圖S5D）。在MALR KO細胞中，HIF1a mRNA的穩定性降低不能通過與1,6-HD一起使用的WT-ILF3來挽救，卻可以通過與對照2,5-HD處理一起使用的WT-ILF3來挽救（圖5D；補充圖S5E和S5F）。綜上所述，這些數據表明MALR-ILF3介導的LLPS在促進HIF1a mRNA穩定性方面起著至關重要的作用。

    如圖5E所示，作者推斷ILF3介導的LLPS可能阻止HIF1a mRNA與PARN之間的相互作用。敲除MALR顯著增加了HIF1a mRNA與PARN的相互作用，這通過RIP-PCR測定得到證實（圖5F）。作者進一步測試了ILF3 KO ESCC細胞中HIF1a mRNA與PARN的相互作用，RIP-PCR測定表明，敲除ILF3顯著增強了HIF1a mRNA與PARN的相互作用，這可以通過在ESCC細胞中過表達shRNA抗性的WT-ILF3來挽救，但不能通過過表達DIDR-ILF3或用1,6-HD處理來挽救（圖5G）。總的來說，這些數據表明，MALR-ILF3介導的LLPS通過防止PARN介導的識別和衰變來維持HIF1a mRNA的穩定性。

    為了進一步研究MALR促進的ILF3相分離對腫瘤細胞惡性行為的影響，作者在MALR KO ESCC細胞中過表達了WT-ILF3或DIDR-ILF3（圖5H）。作者發現，在缺氧條件下培養的MALR敲除細胞中，WT-ILF3的過表達顯著挽救了HIF1a下游分子表達、ILF3點狀形成、糖酵解活性、細胞生長和管狀形成，但在DIDR-ILF3過表達組中則不是這樣（圖5H-L）。這些結果表明，MALR-ILF3介導的LLPS促進ESCC的體外惡性進展。

圖5. MALR-ilf3介導的LLPS維持了HIF1a mRNA的穩定性

  06  MALR-ILF3介導的LLPS促進ESCC的惡性進展  
    接下來，作者研究了MALR-ILF3-HIF1a軸在體內腫瘤發生中的作用。如圖6所示，在ESCC細胞中下調MALR或ILF3顯著降低了基于細胞的異種移植腫瘤的生長（圖6A和B；補充圖S6A和S6B）。此外，Ki-67和CD31（內皮細胞標記）也表明，細胞增殖和血管生成也減少（圖6C；補充圖S6C）。作者通過IHC和IF染色檢測還證實，在異種移植腫瘤組織中，HIF1a表達和ILF3點狀形成在MALR或ILF3敲除后顯著減少（圖6C；補充圖S6C）。這些數據與作者在體外的發現一致。作者按照先前報道的方法將ESCC細胞和巨噬細胞注射到NSG小鼠中，增加了異種移植腫瘤的生長、增殖、血管生成和ILF3點狀形成，這可以通過在巨噬細胞中消耗TNFa以及在ESCC細胞中消耗MALR或ILF3來消除（圖6A-C；補充圖S6A-S6C）。值得注意的是，使用MALR抑制劑敲除MALR可顯著降低腫瘤生長、血管生成和ILF3點狀形成（圖6D-H；補充圖S6F）。綜上所述，這些結果表明MALR在ESCC發展中具有促腫瘤作用。

圖6. MALR-ilf3介導的LLPS促進體內腫瘤生長

  07  ESCC患者中MALR-ILF3-HIF1a軸的臨床相關性  

    為了確定MALR及其上游或下游基因的表達與臨床的相關性，作者檢查了人類ESCC組織中的它們的表達譜。通過qRT-PCR檢測了MALR的表達，并根據中位數表達水平將樣本分為MALR-low和MALR-high組。作者進一步通過IHC分析在ESCC組織隊列中檢查了MALR與TAM標記物（CD68）、腫瘤細胞增殖標記物（Ki-67）和血管生成標記物（CD31）的表達水平之間的相關性（圖7A）。MALR-high組表現出較高的CD68、ILF3、HIF1a、Ki-67和CD31表達，而MALR-low組表現出相反的模式（圖7B）。值得注意的是，MALR的表達與ESCC組織中ILF3點狀的數量呈正相關（圖7C）。此外，MALR的表達與HIF1a及其下游基因在ESCC樣本中的表達呈正相關（圖7D和E）。總之，這些數據表明MALR-ILF3-HIF1a軸在人類癌癥的發展中起著重要的作用（圖7F）。

圖7. ESCC患者中MALR-ILF3-HIF1a軸的臨床相關性

小結  

    本研究發現lncRNA MALR在食管癌中發揮關鍵作用。TAMs通過分泌TNFa上調MALR，進而促進糖酵解和血管生成。MALR與ILF3結合增強HIF1a信號通路，促進腫瘤進展。在臨床樣本中，MALR的高表達與不良預后相關。因此，MALR-ILF3-HIF1a軸可能成為治療食管癌的潛在靶點。