酵母雜交技術(shù)作為一種強大的分子互作研究工具，已在蛋白質(zhì)研究領(lǐng)域占據(jù)了舉足輕重的地位，極大地推動了生命科學(xué)基礎(chǔ)研究以及醫(yī)藥研發(fā)的進程。然而，無論是初涉此領(lǐng)域的科研新手還是經(jīng)驗豐富的研究者，都可能在實施酵母雙雜交實驗的過程中遇到各種困難和挑戰(zhàn)，諸如如何判斷互作強度、如何有效排除假陽性或假陰性結(jié)果、如何處理自激活等問題，常常成為科研工作中的瓶頸。

    鑒于此，依托我司積累的十余年豐富項目經(jīng)驗，我們精心整理了一系列關(guān)于酵母雜交核心技術(shù)的深度Q&A，旨在幫助廣大科研人員更好地理解和掌握這項關(guān)鍵技術(shù)，精準(zhǔn)破解實驗難題，準(zhǔn)確捕捉生物分子間的相互作用，從而順利推進研究項目。

Q：酵母誘餌該選擇全長還是核心區(qū)域，各有什么優(yōu)缺點？

A：

（1）全長：
優(yōu)點：更接近于自然條件下的環(huán)境；
缺點：有時候過于長，導(dǎo)致構(gòu)建具有一定的難度，更可能的產(chǎn)生自激活現(xiàn)象；
 

（2）預(yù)測的核心元件（<20bp）：
優(yōu)點：核心元件用于后續(xù)的EMSA驗證試驗，對核心位點進行突變驗證啟動效果是否減弱，相對全長啟動子而言突變的區(qū)域較少操作更為方便；
缺點：核心元件雖然是啟動的核心區(qū)域，但是啟動子的其他區(qū)域也可能是作為輔助元件而存在的，如果缺少這些部分就是非自然條件下的環(huán)境，可能產(chǎn)生假陰性；
 

（3）蛋白結(jié)構(gòu)功能域：
優(yōu)點：能準(zhǔn)確的研究出這部分區(qū)域是否在全長中行使重要的功能，為同一類型的功能研究具有重要的意義；
缺點：不確定其他功能域是否與它一起行使其他功能，或者需要二者之間的搭配才能行使某一項功能，可能會產(chǎn)生假陰性。

Q：如果誘餌可以直接激活報告基因，該如何處理？

A：為保證誘餌蛋白功能的完整性，首先我們會考慮用3’AT/ABA進行背景抑制，但是由于這兩種試劑對酵母生長具有較大的毒性，后續(xù)可能會影響文庫篩選，因此在3’AT超過15mM，ABA超過1200ng/ml時我們會考慮將誘餌蛋白進行截斷，通過查閱文獻和相關(guān)數(shù)據(jù)庫，截去轉(zhuǎn)錄激活的區(qū)域，但是需要注意的是，截去的這一部分很有可能會影響到互作結(jié)果。

Q：如何根據(jù)自己的研究需求選擇酵母單雜還是雙雜？

A：（1）酵母雙雜交系統(tǒng)主要用于研究蛋白和蛋白之間的互作。

      （2）酵母單雜交系統(tǒng)主要用于研究DNA和蛋白之間的互作。

Q：膜體系為什么要做功能驗證？怎樣進行功能驗證？

A：膜系統(tǒng)載體的選擇主要根據(jù)誘餌跨膜的類型進行選擇，為驗證誘餌載體是否構(gòu)建正確，能在細(xì)胞中形成正常的功能，需要將重組誘餌質(zhì)粒和獵物載體pOST1-NubI共轉(zhuǎn)化酵母菌株中，通過涂布缺陷型和報告基因平板，如果均生長，說明誘餌和獵物的功能域形成了完整的泛素，激活了報告基因的表達，誘餌構(gòu)建無誤，能夠形成正常的定位和功能。

Q：用篩出的陽性結(jié)果做點對點驗證現(xiàn)陰性結(jié)果的原因是什么？

A：（1）酵母雜交本身也是存在假陽性的情況，有可能這兩個基因根本不互作，合成全長進行驗證自然也不會產(chǎn)生互作；

      （2）對于雙雜來說一般是兩個結(jié)構(gòu)域之間的互作，如果互作的兩個基因的結(jié)構(gòu)域恰好處于接觸的狀態(tài)，那么就可以發(fā)生相互作用；

      （3）有些互作為瞬時互作，在文庫篩選時可能捕捉導(dǎo)了互作，而在兩個基因進行單獨驗證時就顯示為陰性；

      （4）有些互作為間接互作，可能需要依靠第三個基因的作用，促進這兩個基因的互作；

      （5）有些蛋白在正天然情況下可能為膜蛋白或者是定位在膜上的蛋白，酵母雜交雖然是模擬體內(nèi)互作，但是與天然狀態(tài)下的蛋白還是有一定的差距的，為保證兩個蛋白在同一空間，誘餌和獵物載體均帶有核定位信號，會強行的將他們定位在核內(nèi)，因此可能會產(chǎn)生假陽性的情況。

Q：如何從驗證結(jié)果判斷兩個蛋白是否互作及互作強度？

A：酵母核雙雜點對點驗證是根據(jù)是否激活3個報告基因（MELI、HIS、Ade2）來反推是否有互作，是否激活了報告基因又是根據(jù)涂布相應(yīng)平板的顏色反應(yīng)及菌落有無及大小來判斷，因此我們可以直接根據(jù)顯藍(lán)的強弱、TDO上斑的多少以及大小、QDO上是否能生長來初步判斷互作的強弱。

Q：篩出的陽性結(jié)果為什么需要重新合成全長而不是片段做回轉(zhuǎn)驗證？

A：（1）片段的序列是基于測序結(jié)果得出來的，可能會有突變和缺失的情況，可能不是一個完整的結(jié)構(gòu)域；

      （2）將陽性測序結(jié)果進行NCBI數(shù)據(jù)庫檢索時，由于為片段式可能會匹配到很多的基因，沒有辦法確定為哪一個基因，需要進行試驗確認(rèn)才能定位到具體的基因，在進行后續(xù)的輔助實驗EMSA，pulldown等實驗時才有理論依據(jù)，否則在發(fā)文章時僅憑不能確定基因的片段并不能作為有力的支撐。

Q：酵母雜交發(fā)生假陽性的原因及解決方式

A：產(chǎn)生原因：

（1）由于BD融合誘餌蛋白有單獨激活作用,或者其激活作用被外來蛋白激活。

（2）AD融合靶蛋白如果有DNA的特異性結(jié)合，也可以單獨激活報告基因的表達。

（3）BD和AD在文庫中會有隨機碰撞導(dǎo)致空間上的接近，以致下游報告基因的表達。

解決方法：

（1）對于點對點驗證來說，可同時將誘餌和獵物進行自激活驗證，減少假陽性的判定，但是一旦誘餌和獵物均產(chǎn)生自激活，后續(xù)自激活的處理方式（截短）會浪費較多的時間；

（2）由于每個報告基因上游的調(diào)控區(qū)各不相同，因此用不同的報告基因驗證陽性，可用于排除或減少假陽性，這也是我們主要采取的方式；

（3）單雜啟動子，我們主要采用將報告基因整合到酵母的染色體上，可以使基因表達水平文檔，消除了由于質(zhì)粒拷貝數(shù)變化引起的基因表達水平的波動而造成的假陽性。

Q：什么是均一化和三框文庫，對文庫質(zhì)量有什么影響？金開瑞對三框文庫是如何處理的？

A：均一化cDNA文庫：是指某一特定組織或細(xì)胞的所有表達基因均包含其中,且在cDNA文庫中表達基因?qū)?yīng)的cDNA的拷貝數(shù)相等或接近。減少冗余轉(zhuǎn)錄物的拷貝而增加低豐度轉(zhuǎn)錄物的拷貝而構(gòu)建的cDNA文庫。簡單說就是降低高峰度的核酸，這樣低峰度核酸就會占比高一些。均一化cDNA文庫是克服基因轉(zhuǎn)錄水平上巨大差異給文庫的篩選和分析帶來障礙的有效措施，有利于研究基因的表達和分析。

    均一化cDNA文庫是克服基因轉(zhuǎn)錄水平上巨大差異給文庫的篩選和分析帶來障礙的有效措施，有利于研究基因的表達和分析。現(xiàn)在，在構(gòu)建均一化cDNA文庫中至少有兩種主要的觀點。一種是基于復(fù)性動力學(xué)的原理，高豐度的cDNA在退火下復(fù)性速度快，而低豐度的cDNA復(fù)性要很長時間，從而可以通過控制復(fù)性時間來降低豐度；另一種是基于基因組DNA在拷貝數(shù)上具有相對均一化的性質(zhì)，通過cDNA和DNA的飽和雜交而降低在文庫中高拷貝存在的cDNA的豐度。

    三框文庫：氨基酸對應(yīng)三個密碼子，文庫中CDNA的片段大小是隨機的，讀碼框也是隨機的，例如ATG，有可能是從A開始翻譯，也有可能是從T或G開始翻譯，這種情況下就只會出現(xiàn)一個正確的讀碼，如果客戶感興趣的基因恰好移碼了，這樣就會提前終止，篩選也不可能被篩出來。三框通過人為的引入一個和兩個堿基，使每個移碼的基因都能正確的被讀出來。傳統(tǒng)的三框文庫均是通過引物的方式人為引入突變的，金開瑞采用載體改造的方式在載體上引入三個不同的讀碼框突變。這樣的三框文庫構(gòu)建只用合成一份雙鏈cDNA，cDNA的合成純化均是在同樣的反應(yīng)條件下進行的，可以完全保證三框文庫的片段長度，文庫滴度等信息的完全一致性，減少三框文庫的差異對篩選結(jié)果的影響。

    金開瑞三框文庫：傳統(tǒng)的三框文庫均是通過引物的方式人為引入突變的，金開瑞采用載體改造的方式在載體上引入三個不同的讀碼框突變。這樣的三框文庫構(gòu)建只用合成一份雙鏈cDNA，cDNA的合成純化均是在同樣的反應(yīng)條件下進行的，可以完全保證三框文庫的片段長度，文庫滴度等信息的完全一致性，減少三框文庫的差異對篩選結(jié)果的影響。

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