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RNA提取經驗總結

信息來源：金開瑞作者：genecreate 發布時間：2018-01-29 13:15:57

實驗前的準備

1、要了解你的實驗室環境，了解你的實驗環境中可能存在的隱患：是否有同事在進行DNA抽提？是否實驗室人員眾多？

2、要了解你可以使用的設備：離心機是否可以低溫操作？破碎、勻漿的條件怎樣？

3、要了解抽提RNA的目的。

4、要了解樣品的采集、制備、保存的條件，了解樣品的特點。

有了充分的了解后，才能正確選擇合適的方法/試劑，提高抽提的成功率。

RNA抽提“三大紀律八項注意”

紀律一：杜絕外源酶的污染。

注意一：嚴格戴好口罩，手套。

注意二：認真處理實驗所涉及到的試劑、耗材、環境。

紀律二：阻止內源酶的活性。

注意三：選擇合適的勻漿方法。

注意四：選擇合適的裂解液。

注意五：控制好樣品的起始量。

注意六：勻漿操作快速而徹底。

紀律三：明確自己的抽提目的。

注意七：任何裂解液系統在接近樣品最大起始量時，抽提成功率急劇下降。

注意八：RNA抽提成功的唯一經濟的標準是后續實驗的一次成功，而不是得率。

RNA抽提的10大竅門

1：快速阻止Rnase活性–樣品收集后快速冷凍，裂解時快速操作滅活Rnase。

2：選擇合適的抽提方法–高核酶含量的組織，脂肪組織最好用含苯酚的方法。

3：預判質量要求– Northern，cDNA文庫構建對完整性要求高，RT-PCR, RPA (Ribonuclease protection assay)對完整性要求不是很高。RT-PCR對純度(酶抑制物殘留)要求很高。

4：徹底勻漿是提高得率和降低降解的關鍵。

5：檢查 RNA的完整性–電泳檢測，28S:18S =2:1是完整的標志，1:1對大部分實驗也是可以接受的。

6：去除DNA –用于RT-PCR, array analysis最好用Dnase I去除DNA。

7：降低外源酶的污染–不能從外面又導入酶。

8：低濃度的核酸濃縮時，要加入助沉淀試劑。但要防止助沉淀劑含酶及DNA污染。

9：徹底溶解RNA，必要時可以65C加熱5分鐘。

10：合適的保存方法–短時間可以–20C保存，長期請保存于–80C。

提高RNA得率的方法

1：使用更有效的破碎/勻漿方法。RNA如果不能被有效釋放出來，得率是會降低的。液氮搗碎、酶消化破壁(Lysozyme/Lyticase)、電動勻漿器勻漿，雖然麻煩，但都是獲得高得率的有效手段。

2：抽提試劑的更換。假如得率低不是由勻漿方法不徹底引起，則可能是所使用的試劑的裂解能力差導致。最合理的做法是：使用更多的裂解液；用完后換廠家。另外，可以改用不使用苯酚/氯仿抽提的試劑/方法；使用苯酚/氯仿抽提的方法，由于不可能全部取出上清，RNA的損失是比較大的。

3：延長沉淀時間。如果核酸濃度低，采取低溫沉淀、并延長沉淀時間，可以獲得非常好的效果。

不同抽提總RNA方法的比較

詳見圖

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