引物修飾的常見類型及應用
信息來源：金開瑞 作者：genecreate 發布時間：2022-11-01 14:58:44
脫氧次黃嘌呤（deoxyInosine，dI）：
脫氧次黃嘌呤是一個自然存在的堿基， 雖然不是真正意義上的通用堿基但當與其它堿基結合時會比其它堿基錯配相對更穩定。 脫氧次黃嘌呤與其它堿基的結合能力為dI:dC > dI:dA > dI:dG > dI:dT. 在DNA聚合酶的催化下，脫氧次黃嘌呤首選與dC結合。
脫氧脲嘧啶 （DeoxyUridine，dU）：
脫氧脲嘧啶可以插進寡核苷酸來增加雙鏈的熔點溫度從而增長雙鏈的穩定性。 每個脫氧胸腺嘧啶被脫氧脲嘧啶替代可以增長雙鏈熔點溫度1.7 ℃。
硫代（Phosphorothioate，S-oligos）：
S-oligos是寡核苷酸中單核苷酸間的磷酸二酯鍵中的一個氧被硫代替后形成的，堿基被添加上后，再進行連接修飾。兩個堿基之間的磷酸可以轉換成雙鍵"S"(用硫代試劑）代替普通的雙鍵"O"（用碘溶液）。
硫代修飾的寡核苷酸主要用于反義實驗中防止被核酸酶降解。 您可以選擇全硫代，但隨著硫代堿基的增加，寡核苷酸的Tm值會降低，為了降低這種這種影響， 可以對引物兩端2-5個堿基進行硫代修飾，通常可以選擇5'和3'各3個堿基進行硫代修飾。
磷酸化（Phosphorylation）：
5'磷酸化是通過B-氰乙基化學反應添加到引物5'端的糖環上，而不是最后一個堿基上。可用于接頭、克隆和基因構建以及連接酶催化的連接反應；在可抗外切酶消化的相關實驗中，也用于阻止DNA聚合酶催化的DNA鏈延伸反應。
內部氨基修飾：
主要用C6-dT aminolinker來加到胸腺嘧啶殘基上來進行內部修飾。修飾后氨基與主鏈相距10個原子距離，可用于進一步的標記和酶連接（如堿性磷酸酶）。
5'氨基修飾：
5'Aminolinker(C6)是在合成循環的最后一步以亞磷酸胺的形式通過B-氰乙基化學反應添加到引物5'糖環上的，而不是添加到最后一個堿基上。5' C6氨基修飾可用于制備功能化的寡核苷酸，廣泛應用在DNA芯片（DNA Microarray）和多重標記診斷系統，目前主要用于連接一些即便靠近寡核苷酸也不會影響其功能的化合物。
3'氨基修飾：
目前提供3'C7氨基修飾，它可用于設計新的診斷探針和反義核苷酸，例如5'端可用高度敏感的32P或熒光素標記的同時3'可用氨基修飾以進行其他的連接。此外，3'修飾可以抑制3'外切酶酶解，從而可用于反義實驗。
巰基（Thiol）：
5'-巰基在很多方面與氨基修飾類似。巰基可用于加附各種修飾如熒光標記物和生物素。 例如可在碘乙酸和馬來酰亞胺衍生物存在下制作巰基連接的熒光探針。 5'巰基修飾主要用5'巰基修飾單體（5'-Thiol-Modifier C6-CE Phosphoramidite 或Thiol-Modifier C6 S-S CE Phosphoramidite）， 用5'-Thiol-Modifier C6-CE單體修飾后必須進行硝酸銀氧化以去除保護基（trityl），而Thiol-Modifier C6 S-S CE單體修飾后須用DTT將二硫鍵還原成巰基。
生物素（Biotin）：
生物素修飾的寡核苷酸能緊緊地結合在鏈霉親和素蛋白上，鏈霉親和素蛋白可以標記上熒光染料和酶或作為附著的中間結合物附著在固體物生物表面，不同的分子生物學和純化方法都包含生物素修飾。生物素修飾可以利用C6或是TEG間臂被添加在寡核苷酸的5’或末端，生物素TEG需要純化，中間的生物素修飾可以通過dT堿基加入，這種形式需要更多的純化步驟。引物生物素標記，可用于非放射性免疫分析來檢測蛋白質、胞內化學染色、細胞分離、核酸分離、雜交檢測特異性的DNA/RNA序列、離子通道構象變化等。
地高辛 （Digoxigenin）：
地高辛是一種從毛地黃植物分離出來的類固醇物質，因為毛地黃植物的花和葉子是這種物質唯一自然來源，所以抗地高辛抗體不會結合到其他生物物質。地高辛經由一個11個原子的間臂連接到脲嘧啶的C5位置。雜交的地高辛探針可以由抗地高辛抗體來檢測，這個抗體一般會與堿性磷酸酶、過氧化物酶、熒光素或膠體金偶連。或沒有偶連的抗地高辛抗體但偶連的抗體。地高辛標記的探針可用于各種雜交反應，如DNA-DNA雜交（Southern blotting）、DNA-RNA雜交（Northern blotting）、斑點雜交（Dot blotting ）、克隆雜交、原位雜交及酶聯免疫分析（ELISA）。
間臂（Spacer）：
Spacer可為寡核苷酸標記提供必要的間隔以減少標記基團與寡核苷酸間的相互作用，主要應用于DNA發夾結構和雙鏈結構研究。 C3 spacer主要用于模仿核糖的3'和5'羥基間的三碳間隔，或“替代”一個序列中未知的堿基。 3'-Spacer C3用于引進一個3'間臂從而阻止3'端外切酶和3'端聚合酶發揮作用。 Spacer 18常用于引進一個強疏水基團。
附：常見熒光染料參數
脫氧次黃嘌呤是一個自然存在的堿基， 雖然不是真正意義上的通用堿基但當與其它堿基結合時會比其它堿基錯配相對更穩定。 脫氧次黃嘌呤與其它堿基的結合能力為dI:dC > dI:dA > dI:dG > dI:dT. 在DNA聚合酶的催化下，脫氧次黃嘌呤首選與dC結合。
脫氧脲嘧啶 （DeoxyUridine，dU）：
脫氧脲嘧啶可以插進寡核苷酸來增加雙鏈的熔點溫度從而增長雙鏈的穩定性。 每個脫氧胸腺嘧啶被脫氧脲嘧啶替代可以增長雙鏈熔點溫度1.7 ℃。
硫代（Phosphorothioate，S-oligos）：
S-oligos是寡核苷酸中單核苷酸間的磷酸二酯鍵中的一個氧被硫代替后形成的，堿基被添加上后，再進行連接修飾。兩個堿基之間的磷酸可以轉換成雙鍵"S"(用硫代試劑）代替普通的雙鍵"O"（用碘溶液）。
硫代修飾的寡核苷酸主要用于反義實驗中防止被核酸酶降解。 您可以選擇全硫代，但隨著硫代堿基的增加，寡核苷酸的Tm值會降低，為了降低這種這種影響， 可以對引物兩端2-5個堿基進行硫代修飾，通常可以選擇5'和3'各3個堿基進行硫代修飾。
磷酸化（Phosphorylation）：
5'磷酸化是通過B-氰乙基化學反應添加到引物5'端的糖環上，而不是最后一個堿基上。可用于接頭、克隆和基因構建以及連接酶催化的連接反應；在可抗外切酶消化的相關實驗中，也用于阻止DNA聚合酶催化的DNA鏈延伸反應。
內部氨基修飾：
主要用C6-dT aminolinker來加到胸腺嘧啶殘基上來進行內部修飾。修飾后氨基與主鏈相距10個原子距離，可用于進一步的標記和酶連接（如堿性磷酸酶）。
5'氨基修飾：
5'Aminolinker(C6)是在合成循環的最后一步以亞磷酸胺的形式通過B-氰乙基化學反應添加到引物5'糖環上的，而不是添加到最后一個堿基上。5' C6氨基修飾可用于制備功能化的寡核苷酸，廣泛應用在DNA芯片（DNA Microarray）和多重標記診斷系統，目前主要用于連接一些即便靠近寡核苷酸也不會影響其功能的化合物。
3'氨基修飾：
目前提供3'C7氨基修飾，它可用于設計新的診斷探針和反義核苷酸，例如5'端可用高度敏感的32P或熒光素標記的同時3'可用氨基修飾以進行其他的連接。此外，3'修飾可以抑制3'外切酶酶解，從而可用于反義實驗。
巰基（Thiol）：
5'-巰基在很多方面與氨基修飾類似。巰基可用于加附各種修飾如熒光標記物和生物素。 例如可在碘乙酸和馬來酰亞胺衍生物存在下制作巰基連接的熒光探針。 5'巰基修飾主要用5'巰基修飾單體（5'-Thiol-Modifier C6-CE Phosphoramidite 或Thiol-Modifier C6 S-S CE Phosphoramidite）， 用5'-Thiol-Modifier C6-CE單體修飾后必須進行硝酸銀氧化以去除保護基（trityl），而Thiol-Modifier C6 S-S CE單體修飾后須用DTT將二硫鍵還原成巰基。
生物素（Biotin）：
生物素修飾的寡核苷酸能緊緊地結合在鏈霉親和素蛋白上，鏈霉親和素蛋白可以標記上熒光染料和酶或作為附著的中間結合物附著在固體物生物表面，不同的分子生物學和純化方法都包含生物素修飾。生物素修飾可以利用C6或是TEG間臂被添加在寡核苷酸的5’或末端，生物素TEG需要純化，中間的生物素修飾可以通過dT堿基加入，這種形式需要更多的純化步驟。引物生物素標記，可用于非放射性免疫分析來檢測蛋白質、胞內化學染色、細胞分離、核酸分離、雜交檢測特異性的DNA/RNA序列、離子通道構象變化等。
地高辛 （Digoxigenin）：
地高辛是一種從毛地黃植物分離出來的類固醇物質，因為毛地黃植物的花和葉子是這種物質唯一自然來源，所以抗地高辛抗體不會結合到其他生物物質。地高辛經由一個11個原子的間臂連接到脲嘧啶的C5位置。雜交的地高辛探針可以由抗地高辛抗體來檢測，這個抗體一般會與堿性磷酸酶、過氧化物酶、熒光素或膠體金偶連。或沒有偶連的抗地高辛抗體但偶連的抗體。地高辛標記的探針可用于各種雜交反應，如DNA-DNA雜交（Southern blotting）、DNA-RNA雜交（Northern blotting）、斑點雜交（Dot blotting ）、克隆雜交、原位雜交及酶聯免疫分析（ELISA）。
間臂（Spacer）：
Spacer可為寡核苷酸標記提供必要的間隔以減少標記基團與寡核苷酸間的相互作用，主要應用于DNA發夾結構和雙鏈結構研究。 C3 spacer主要用于模仿核糖的3'和5'羥基間的三碳間隔，或“替代”一個序列中未知的堿基。 3'-Spacer C3用于引進一個3'間臂從而阻止3'端外切酶和3'端聚合酶發揮作用。 Spacer 18常用于引進一個強疏水基團。
附：常見熒光染料參數
相關技術服務
推薦閱讀
最新動態
-
09.23
中藥的現代詮釋：外泌體如何革新傳統醫學？
-
07.02
1+1＞2！深度解析RNA測序數據挖掘邏輯和后期實驗設計思路，輕松研獲10+ SCI
-
07.01
“稻”亦有道——盤點近期水稻研究的重大突破
-
06.28
科學與美學的結合體：植物亞細胞定位技術詳解
-
06.28
“聚焦新質生產力，激發科研新動能”|LCA躋身蛋白互作研究的新銳力量
-
06.05
知無不“研”|一文讀懂免疫共沉淀技術（Co-IP）
-
05.14
四大研究利器(Co-IP、BIFC、Y2H、GST pull-down)助力速配蛋白互作“最佳拍檔”
-
05.14
高效、精準、直觀、實時——取經“蛋白互作研究翹楚”BIFC！
-
05.14
轉染效率低、干擾效果差、重復性欠佳...siRNA研究頻遇“攔路虎”怎么辦？
-
04.22
一文讀懂EMSA技術核心要點，讓“emsa” 秒變“easy”
X 
