眾所周知Co-IP（免疫共沉淀，co-inmunoprecipitation）是經典的利用抗體從樣品中捕獲靶蛋白及其互作蛋白、復合體的一項技術，能夠特異性富集所研究的目的蛋白。由于過程中采用了非變性條件，保留了互作及復合體的細胞內狀態。相對于酵母雙雜交、pull down等方法，其特色之一便是捕獲的蛋白互作發生在所研究的特定組織細胞內，保存了互作蛋白及復合體的“內源”狀態。本文重在介紹Co-IP同蛋白質譜技術聯用，進行高效篩選鑒定未知互作蛋白。

        經典Co-IP流程在收集捕獲產物之后，通過SDS-PAGE、銀染分析差異條帶、Western Blot來鑒定某些預設的互作蛋白。這種途徑限于通量、抗體等因素，適合點對點驗證。CoIP-MS即為將免疫共沉淀和蛋白質譜技術串聯，運用LC-MS/MS技術對Co-IP所捕獲的蛋白產物進行鑒定分析的技術。相比于MALDI-TOF， LC-MS/MS方法具有更高的靈敏度和幾乎100%的可靠性，是主流文獻中最常用的方法。

        在對樣本進行非變性條件的蛋白提取之后，Co-IP所獲產物進行SDS-PAGE分離不同大小的蛋白，蛋白質還原烷基化及酶解，除鹽之后的酶解產物進行LC-MS/MS鑒定，將下機數據進行數據庫檢索，獲取產物中蛋白信息。之后再進一步進行對照組及樣品組的韋恩分析，鑒定蛋白質的GO、COG和KEGG注釋分析，以預測蛋白質的功能，揭示蛋白質在各個生命活動中的生物學意義。

（引自Keller-Pinter A, Ughy B, Domoki M,et al. The phosphomimetic mutation of syndecan-4 binds and inhibits Tiam1 modulating Rac1 activity in PDZ interaction-dependent manner. PLoS One. 2017 Nov 9;12(11):e0187094.）

1. 樣品蛋白提取

        為了保持目的蛋白本身及其互作蛋白、復合體的天然狀態，不遺漏互作蛋白信息，Co-IP樣品的蛋白提取應注意：不使用SDS、Sodium deoxycholate等離子型去垢劑，不能使用尿素、硫脲等強變性劑，也不能經過丙酮/TCA沉淀等導致蛋白變性的有機試劑處理。只能使用如NP-40、Triton X-100等非離子型去垢劑。此外，包括凍融、超聲處理等條件也會不同程度破壞蛋白復合物的存在狀態。因此，如何既保護蛋白活性又獲取較高的提取效率，需要借助經驗及預實驗來確定實驗條件。
 

2. 免疫共沉淀Co-IP

        在Co-IP過程中，除了所用抗體性能達到IP級別的親和力是先決條件之外，孵育體系中的總蛋白濃度、抗體用量、漂洗條件等方面也決定Co-IP過程的靈敏度以及特異性。通常總蛋白濃度需要≥1mg/ml，當總蛋白濃度足夠高時，可以適當倍數稀釋樣品以降低其中去垢劑濃度，為抗體反應提供溫和環境。使用protein A/G的磁珠或凝膠時不宜貪多，目前商品化產品其載量都在50ul用量時承載50ug或更多抗體，而通常一個Co-IP反應的用量在1-3ug左右。漂洗緩沖液需要控制適當的鹽離子強度、去垢劑種類及濃度，通常會延用裂解液緩沖液配方，因為背景蛋白在后續質譜過程中會干擾蛋白的鑒定，優化漂洗緩沖液的目的是既保持目的蛋白復合物的捕獲效率又盡量減少非特異結合蛋白。

 

3. 質譜上機前樣本處理

        蛋白質還原烷基化和酶解。蛋白質的還原烷基化如下，加入二硫蘇糖醇(DTT)還原蛋白質，再加入碘乙酸銨(IAM)，最后加入Trypsin酶，過夜酶解，酶解后處理。酶解產生的多肽用C18柱子除鹽，已經除鹽的多肽抽干后用Loading Buffer (含甲酸、乙腈)溶解多肽。多肽上LC-MS/MS儀器進行分析，然后對結果進行評估。

                         

（引自Chen R, Xiao M, Gao H, et al. Identification of a novel mitochondrial interacting protein of C1QBP using subcellular fractionation coupled with CoIP-MS.[J]. Analytical & Bioanalytical Chemistry, 2016, 408(6):1557-1564.）

 

4. 數據檢索、蛋白鑒定

        LC-MS/MS下機后，將原始下載數據直接提交到與質譜儀連接的Proteinpilot軟件中進行數據庫檢索，過濾掉常見污染蛋白及與之匹配的肽段，得到每個樣品鑒定到的肽段和蛋白結果。通常CoIP-MS是將IgG組及IP同時進行質譜鑒定，得到的反應兩組蛋白差異的韋恩圖。

 

5. 鑒定蛋白功能注釋

        對鑒定到的蛋白質進行GO、COG和KEGG注釋分析，以預測蛋白質的功能，揭示蛋白質在各個生命活動中的生物學意義。其中，GO分析總共有三個本體（ontology），分別描述基因的分子功能（molecular function）、細胞組分（cellular component）、參與的生物過程（biological process）；COG是對蛋白質進行直系同源分類的數據庫；KEGG是有關Pathway的主要公共數據庫，通過Pathway分析能確定蛋白質參與的最主要生化代謝途徑和信號轉導途徑。

 

        由于一些樣本中目的蛋白含量本身不高，同時其互作蛋白、互作復合體存在的豐度則進一步降低，因而CoIP-MS需要保證樣品充足的上樣量（動物細胞2-10 x 107，植物組織1-3g）。一些細胞模型需要預先進行條件刺激或者基因表達干預，金開瑞生物除了可以進行細胞培養、條件刺激（包括加藥、缺氧等條件），還能先構建穩定細胞株作為樣本CoIP-MS實驗。因為在本身實驗需要細胞量較大的情況下，進行瞬時轉染不僅一次上機便會消耗大量轉染試劑導致成本不菲、同時其過表達/敲降效率還無法穩定，所以先構建穩定細胞株成為一種不錯的途徑。