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ChIP（染色質(zhì)免疫沉淀）實(shí)驗(yàn)心得

信息來源：金開瑞作者：genecreate 發(fā)布時(shí)間：2018-07-12 16:59:40

基于體內(nèi)分析而發(fā)展的染色質(zhì)免疫沉淀分析（Chromatin immunoprecipitation assay kit,ChIP）技術(shù)可以真實(shí)、完整地反映結(jié)合在DNA序列上的調(diào)控蛋白。由于ChIP采用甲醛固定活細(xì)胞或者組織的方法，因此能比較真實(shí)的反映細(xì)胞內(nèi)TF與Promoter的結(jié)合情況，還可以用來研究組蛋白的各種共價(jià)修飾與基因表達(dá)的關(guān)系。近年來，這種技術(shù)得到不斷的發(fā)展和完善。采用結(jié)合微陣列技術(shù)在染色體基因表達(dá)調(diào)控區(qū)域檢查染色體活性，是深入分析癌癥、心血管病以及中央神經(jīng)系統(tǒng)紊亂等疾病主要通路的一種非常有效的工具。

染色質(zhì)免疫沉淀分析（ChiP）的基本原理是在活細(xì)胞狀態(tài)下，當(dāng)用甲醛處理時(shí)，相互靠近的蛋白與蛋白、蛋白與核酸（DNA或RNA）之間會(huì)產(chǎn)生共價(jià)鍵。細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)TF與Promoter相互結(jié)合時(shí)，它們必然靠的比較近或者契合在一起，這個(gè)時(shí)候用甲醛處理，能使它們之間產(chǎn)生共價(jià)鍵。固定的蛋白質(zhì)－DNA復(fù)合物通過超聲或酶處理將其隨機(jī)切斷為一定長度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段，然后通過抗原抗體的特異性識(shí)別反應(yīng)沉淀此復(fù)合體，特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段，通過對(duì)目的片斷的純化與檢測(cè)，從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息。通過qPCR或二代測(cè)序，篩選與目的蛋白互作的未知DNA信息。

今天小編將ChIP實(shí)驗(yàn)的一點(diǎn)心得體會(huì)拿出來與大家一同分享。

（一）關(guān)于細(xì)胞

細(xì)胞的生長狀態(tài)要好。因?yàn)榧?xì)胞的生長狀態(tài)直接影響細(xì)胞內(nèi)部的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，也很有可能影響所研究的TF與其靶Promoter的結(jié)合。一般而言，細(xì)胞密度長到75％－80％比較好。

（二）關(guān)于抗體

抗體是實(shí)驗(yàn)成敗的致命因素之一！必須是IP級(jí)別的抗體，單抗與多抗的選擇也需要仔細(xì)考慮。單抗和多抗兩種抗體各有利弊。單抗特異性強(qiáng)，背景低。但是單抗有一個(gè)弱點(diǎn)，就是識(shí)別位點(diǎn)單一，而在ChIP甲醛交聯(lián)的過程中，很有可能該位點(diǎn)被其它蛋白或核酸結(jié)合而被封閉，導(dǎo)致單抗不能識(shí)別靶蛋白。多抗雖然沒有這個(gè)問題，但是多抗特異性較差，背景可能會(huì)偏高。一般而言，如果沒有十足把握，比如單抗的識(shí)別位點(diǎn)遠(yuǎn)離靶蛋白與核酸結(jié)合的區(qū)域），建議選擇多抗比較穩(wěn)妥一點(diǎn)。

（三）關(guān)于交聯(lián)與超聲破碎

交聯(lián)與超聲破碎的確是ChIP實(shí)驗(yàn)中比較難把握的部分。交聯(lián)的程度會(huì)影響到超聲破碎的效果，交聯(lián)的程度越高，超聲破碎就越不易把基因組打碎成小片段。交聯(lián)不充分，只有一部分靶蛋白與其Promoter相結(jié)合，富集得到的Promoter的量不高，實(shí)驗(yàn)易出現(xiàn)假陰性。交聯(lián)過充分，基因組上結(jié)合了太多的蛋白，對(duì)超聲破碎造成障礙，另外也會(huì)增加背景。可以通過超聲結(jié)果來判斷超聲效果，超聲破碎后的DNA片段大小一般在100-500bp是效果比較好的，因?yàn)椴煌臉颖窘宦?lián)時(shí)間和超聲時(shí)間不同，可以提前通過預(yù)實(shí)驗(yàn)來確定。

一般來講，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，交聯(lián)條件取決于細(xì)胞類型。不同的細(xì)胞系，交聯(lián)的條件也不一樣。例如，NIH－3T3的交聯(lián)條件是室溫（一般為25 ℃）下15min，1％的甲醛濃度，不同的細(xì)胞系則可能完全不一樣。而超聲破碎的條件，機(jī)器不一樣，條件也不一樣。

（四）關(guān)于操作

操作時(shí)，盡可能的保持低溫（4度）。沉淀的時(shí)候可以先在4度放置一會(huì)，等它自然沉降一些，再超低轉(zhuǎn)速（500 rpm等）離心使其完全沉降。雖然說明書上說ChIP實(shí)驗(yàn)的過程中有幾個(gè)可以停頓的地方，但最好還是能夠連續(xù)把它做完，直到PCR結(jié)果出來為止，盡量避免實(shí)驗(yàn)中不可預(yù)知的影響因素。

（五）關(guān)于解交聯(lián)

一般說明書上會(huì)說4小時(shí)已經(jīng)足夠，但依據(jù)經(jīng)驗(yàn)，可以解交聯(lián)過夜。因?yàn)樵谶@種的環(huán)境里，DNA不會(huì)降解，過夜解交聯(lián)更充分。這里提醒一點(diǎn)，解交聯(lián)過夜不要忘記在EP管口封上封口膜。

應(yīng)用舉例

題目：Hypoxia induces H19 expression through direct and indirect Hif-1α activity, promoting oncogenic effects in glioblastoma

期刊：scientific reports

主要結(jié)論：作者分別使用了兩種細(xì)胞U87和U251，驗(yàn)證SP1對(duì)于H19的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。用SP1抗體進(jìn)行ChIP實(shí)驗(yàn)，對(duì)H19的啟動(dòng)子區(qū)域上游100bp的高GC含量，設(shè)計(jì)引物。富集到的DNA進(jìn)行qPCR檢測(cè)，結(jié)果顯示SP1能夠調(diào)控H19啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。