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天然和人工培育冬蟲夏草的比較蛋白質學表征及其營養價值評估

信息來源：金開瑞作者：genecreate 發布時間：2018-07-13 11:45:27

題目：A comparative proteomic characterization and nutritional assessment of naturally-and artificially-cultivated Cordyceps sinensis

期刊：Journal of Proteomics

影響因子：3.722

合作技術：Label-free

研究背景

冬蟲夏草因其營養和藥用價值而受到越來越多的關注。近期，有報道稱，成功通過人工方式培育出冬蟲夏草。本文主要使用非標定量Label-free蛋白質組學技術研究自然生長和人工培育的冬蟲夏草之間的蛋白質組學差異，揭示冬蟲夏草蛋白質組學特征，了解其發育感染過程，并為人工培育提供參考信息。

研究思路

1. 實驗材料：天然蟲草和人工培育蟲草，各分為蟲體和子座，每個樣本3個重復，共計12個樣本。

2. 實驗方法：Label-free，LC-MS

3. 研究策略：蛋白組、代謝組

研究內容和結果

1. 蛋白組學數據結果及蛋白質控

人工培育的蟲草和青藏高原上自然生長的蟲草在形態特征高度相似（圖1），并各自選擇3個批次的樣本進行蛋白提取。將蟲草分為蟲體和子座，分別用SDS-PAGE對樣本蛋白進行質控檢測（圖2）。

對解析的蛋白質組學數據進行質控分析，肽段質量容差為0.1Da，說明質譜鑒定肽段準確度高，肽段長度范圍為8-38個氨基酸，分子量范圍為400-12000Da，與預設分子量范圍一致。在本次實驗中，大多數鑒定蛋白含有2-20個unique肽段。

圖1 天然蟲草和人工培育蟲草形態比對

圖2 樣品蛋白SDS-PAGE質控結果

使用變異系數（CV）驗證實驗方法的重復性，在本次實驗結果中，人工培育的蟲體（AC）、子座（AS）、天然生長的蟲體（NC）、子座（NS）的CV值中位數分別為31.88%，27.44%，34.49%，34.94%。12個樣品的相關性系數在0.68-0.93之間，這些結果證明了實驗的可重復性。在所有的鑒定蛋白中，基于強度的絕對定量（iBAQ）值分布在1200中最豐富的蛋白質中（圖3A）。所有樣品和組內蛋白質的平均iBAQ值相似（圖3B）。這些結果表明蛋白質組內比較可能不受蛋白質豐度系統差異的影響。

圖3 鑒定蛋白的絕對定量值（iBAQ）分布

2. 天然蟲草和人工培育蟲草的蛋白表達圖譜

在本次實驗中，12個樣品共鑒定到22829條可信肽段（conf ≥ 95%），2541個蛋白質。使用PCA分析天然蟲草和人工培育蟲草蛋白表達圖譜特征，發現雖然蟲體和子座蛋白質分布有明顯區別，但是天然蟲草和人工培育蟲草的整體蛋白質分布類似（圖4）。COG功能注釋到了1951個蛋白質。這些蛋白質主要參與能量產生、轉化，氨基酸轉運、代謝和轉錄調節（圖5）。

圖4 PCA分析結果

圖5 COG功能注釋結果

3. 顯著差異蛋白質鑒定結果

本次實驗中，顯著差異蛋白數目分別為107（NC/AC）、58（NS/AS），195（AC/AS）、168（NC/NS）。使用層次聚類分析蛋白質表達變化趨勢，主要聚成三類，Cluster I 由在AS中增加并在NC中減少的蛋白質組成；Cluster II包括在AC中降低并在NS中增加的蛋白質；Cluster III包括在AC或NC中增加并在AS和NS中均降低的蛋白質（圖6）。為了確定這些蛋白質的功能特性，將它們的序列映射到GO數據庫。GO富集表明這些差異豐富的蛋白質主要參與生物調節、單一生物過程，結合、催化活性，并定位于細胞器、細胞膜。結果說明這些顯著差異蛋白在蟲草生命活動中主要發揮催化和結合作用（圖7）。

圖6層次聚類分析結果

圖7 差異蛋白GO富集結果

4. 顯著差異蛋白Pathway Enrichment 結果

為了進一步研探索發生變化的生物學途徑，使用KEGG Pathway 數據庫進行富集分析，結果表明，天然蟲草和人工培育蟲草之間的差異蛋白主要參與次生代謝物合成、丙酮酸代謝、賴氨酸生物合成。在氨基酸合成、代謝途徑中（圖8），有7種相關蛋白發生表達量變化，其中，核糖5-磷酸異構酶（K01807）和丙酮酸激酶（K00873）在NC中降低，而NADH（P）結合蛋白（K00831）在NC中增加； NS中糖基轉移酶（K00766）和雄性不育蛋白（K00143）增加；異檸檬酸/異丙基蘋果酸脫氫酶（K00052）在NC中降低但在NS中升高，精氨酸琥珀酸合成酶（K01940）在NC和NS中均下降。

圖8 氨基酸合成/代謝途徑

為了驗證組學結果，LC-MS分析蟲草代謝產物。根據代謝組學結果，共鑒定出8種氨基酸，其中4種氨基酸含量發生顯著改變，具體為賴氨酸，精氨酸，蘇氨酸和絲氨酸（圖9）。氨基酸的變化趨勢跟上游合成它們的酶的變化趨勢是一直的。根據中國藥典中關于測定核苷和核苷酸含量，特別是腺苷的規定，NC/NS以及AC/AS總離子色譜圖中沒有觀察到顯著差異（圖10）。

圖9 代謝組鑒定結果

圖10 核苷酸含量測定

蟲草蛋白質中必須氨基酸比例與人類蛋白質中的比例相似，說明它具有營養價值。而且，天然蟲草和人工培育蟲草蛋白質中氨基酸成分和含量幾乎相同，沒有顯著差異。

文章小結

該研究提供了天然蟲草和人工培育蟲草的蛋白表達圖譜，發現天然蟲草和人工培育蟲草的真菌中的蛋白質和代謝產物組成相似，而蟲體和子座的蛋白質和代謝產物方面則有區別。蛋白質組學結果表明氨基酸合成和代謝途徑受到栽培方式的影響。這些蛋白質組學數據將有助于理解冬蟲夏草的藥用價值，并為其人工培育提供參考。

解析文獻

Xu Zhang, Qun Liu, Wei Zhou,et al. A comparative proteomic characterization and nutritional assessment of naturally-and artificially-cultivated Cordyceps sinensis. Journal of Proteomics, 2018, 181:24-35.

參考文獻

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3. Hu HK, Xiao L, et al. Identification of chemical markers in Cordyceps sinensis by HPLC-MS/MS. Anal and Bioanal Chem 2015;407:8059–8066.

4. Bereman MS, Beri J, Sharma V. An automated pipeline to monitor system performance in liquid chromatography-tandem mass spectrometry proteomic experiments. J Proteome Res 2016;15:4763-9.

5. Xia E-H, Yang D-R, et al. The caterpillar fungus, Ophiocordyceps sinensis, genome provides insights into highland adaptation of fungal pathogenicity. Sci Rep 2017;7:1806.

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天然和人工培育冬蟲夏草的比較蛋白質學表征及其營養價值評估