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蛋白質表達、分離、純化步驟詳解

信息來源：金開瑞作者：genecreate 發布時間：2022-11-01 13:55:13

金開瑞蛋白表達平臺擁有原核、真核、無細胞等六大重組蛋白表達系統，已成功為客戶研發出3000余種重組蛋白產品，涵蓋細胞因子、激素、酶、病毒抗原和人類疾病相關蛋白等類別。平臺擁有50-500L 大規模發酵平臺、1m2凍干機、1500bar高壓均質機等，可進行10g級重組蛋白制備。改造的表達載體和優化的實驗流程，可在最短時間獲得最高的產量。

蛋白質表達、分離、純化可以：

（1）探索和研究基因的功能以及基因表達調控的機理；

（2）供作結構與功能的研究；

（3）作為催化劑、營養劑等。

實驗步驟

一：材料準備

1. 實驗材料：大腸桿菌 BL21、LB 液體培養基、氨芐青霉素、Washing Buffer、Elution Buffer、IPTG、蒸餾水、胰蛋白胨、酵母粉、氯化鈉

2. 實驗儀器：搖床、離心機、層析柱、離心管、移液槍、槍頭盒、燒杯、玻璃棒

二：實驗操作

1. 試劑準備

2. 獲得目的基因

① PCR 方法：以含目的基因的克隆質粒為模板，按基因序列設計一對引物（在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點），PCR 循環獲得所需基因片段。

② 通過 RT-PCR 方法：用 TRIzol 法從細胞或組織中提取總 RNA，以 mRNA 為模板，逆轉錄形成 cDNA 第一鏈，以逆轉錄產物為模板進行 PCR 循環獲得產物。

3. 構建重組表達載體

① 載體酶切：將表達質粒用限制性內切酶（同引物的酶切位點）進行雙酶切，酶切產物行瓊脂糖電泳后，用膠回收 Kit 或凍融法回收載體大片段。

② PCR 產物雙酶切后回收，在 T4DNA 連接酶作用下連接入載體。

4. 獲得含重組表達質粒的表達菌種

① 將連接產物轉化大腸桿菌 DH5α，根據重組載體的標志（抗 Amp 或藍白斑）作篩選，挑取單斑，堿裂解法小量抽提質粒，雙酶切初步鑒定。

② 測序驗證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確，進入下步操作。否則應篩選更多克隆，重復亞克隆或亞克隆至不同酶切位點。

③ 以此重組質粒 DNA 轉化表達宿主菌的感受態細胞。

5. 氯霉素?；D移酶重組蛋白的誘導

① 接種含有重組氯霉素?；D移酶蛋白的大腸桿菌 BL21 菌株于 5 mL LB 液體培養基中（含 100 ug/mL 氨芐青霉素），37 ℃ 震蕩培養過夜。

② 按 1∶50 或 1：100 的比例稀釋過夜菌，一般轉接 1 mL 過夜培養物于 100 mL（含 100 ug/mL 氨芐青霉素）LB 液體培養基中，37℃ 震蕩培養至 OD600 = 0.6 - 0.8（最好 0.6，大約需 3 h）。取 10 ul 樣品用于 SDS-PAGE 分析。

③ 對照組不加誘導劑，實驗組加入 IPTG 至終濃度 0.5 mmol/l，37℃ 繼續培養 1-3 h。

④ 12 000 rpm 離心 10 min，棄上清，菌體沉淀保存于 -20 ℃ 或 -70 ℃ 冰箱中。

6. 氯霉素?；D移酶重組蛋白的分離、純化

① NTA 層析柱的準備：在層析柱中加入 1 mL NTA 介質，并分別用 8 mL 去離子水，8 mL 上樣緩沖液洗滌。

② 重組蛋白的變性裂解：在冰浴中凍融菌體沉淀，加入 5 mL 上樣緩沖液，用吸管抽吸重懸，超聲波破裂菌體，用振蕩器等輕柔的混勻樣品 60 min，4℃ 12000 rpm 離心 30 min，將上清吸至一個干凈的容器中，并棄沉淀。取 10 ul 上清樣品用于 SDS-PAGE 分析。

③ 上清樣品以 10-15 mL/h 流速上 Ni2+-NTA 柱，收集流出液，取 10 ul 樣品用于 SDS-PAGE 分析。

④ 洗脫雜蛋白：用 Washing Buffer 以 10-15 mL/h 流速洗柱，直至 OD280 = 0.01 分步收集洗脫液，約 3-4 h，取 10 ul 洗脫開始時的樣品用于 SDS-PAGE 分析。

⑤ 洗脫目標蛋白：用 Elution Buffer 洗柱，收集每 1 mL 級分，分別取 10 ul 樣品用于 SDS-PAGE 分析。

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