病毒包裝是生物醫學研究中的一大利器，通過病毒可以高效地讓要研究的基因在目標細胞中過表達或者特異性地敲低細胞中的目標基因。慢病毒（Lentivirus）是逆轉錄病毒的一種，慢病毒載體是以HIV-1（人類免疫缺陷1型病毒）為基礎發展起來的病毒載體。慢病毒載體系統包含了包裝、轉染、穩定整合所需要的遺傳信息，無需任何轉染試劑，操作簡便，已廣泛應用于基因治療、藥物研究、快速建立生產目的蛋白細胞系等方面。

        這里，小編以一篇經典文獻帶您了解慢病毒包裝在醫學生物學中的應用。
 

題目：EZH2 regulates neuroblastoma cell differentiation via NTRK1 promoter epigenetic modifications（EZH2通過NTRK1啟動子的表觀遺傳修飾來調節神經母細胞瘤的細胞分化）

期刊：Oncogene

影響因子：6.854

發表時間：20180306

主要技術：慢病毒包裝、穩轉株、RT-PCR、Western blot、轉錄組測序、免疫染色、DNA甲基化分析、ChIP-qPCR

 

研究背景：

       神經母細胞瘤（NB）是源于交感神經系統的第二常見的固體惡性腫瘤。盡管目前針對NB可進行多種模式的綜合治療，神經母細胞瘤仍然是最難治愈的腫瘤之一，NB患者只有40%的存活率。EZH2是PcG蛋白家族的成員，在前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、胃癌等癌癥細胞中EZH2的表達上調。雖然最近已經開發出EZH2的抑制劑，然而它們在這些惡性腫瘤中的有效性和分子作用機制尚未被闡明，目前的研究也尚未對EZH2的突變功能進行報道。已有研究表明，表觀遺傳修飾（如CASP8啟動子甲基化和CpG島甲基化）對NB的腫瘤發生和侵襲具有一定影響。為了闡明EZH2在NB腫瘤發生中的功能，本文使用慢病毒系統對NB細胞中的EZH2表達進行干擾，結合多項實驗技術獲得的結果表明EZH2在預防NB細胞分化中發揮重要作用，且EZH2相關的NTRK1轉錄調控可能是NB細胞分化的關鍵途徑。

 

研究內容及結果：

1 敲降EZH2促進NB細胞的分化

        采用shEZH2慢病毒感染NB-39-nu細胞后，發現EZH2的敲降能夠強烈地促進神經突觸延伸，并且神經元細胞分化標記蛋白GAP43和NF68的表達均產生上調。隨著shEZH2干擾作用的加強，受EZH2催化的H3K27三甲基化信號明顯減少。裸鼠皮下成瘤的結果表明shEZH2穩定轉化NB-39-nu細胞形成的腫瘤與對照組相比顯著減?。▓D1）。

Fig. 1 Knockdown of EZH2 promotes neurite extension and induces

neuronal markers

 

2 EZH2敲低細胞的轉錄組分析

        對shEZH2-NB-39-nu細胞進行轉錄組分析發現，表達顯著上調的基因中很多涉及神經及凋亡相關通路。在這些基因中，作者將焦點關注在神經營養性酪氨酸激酶受體家族成員——NTRK1。通過RT-PCR、real-time PCR、Western blot以及免疫染色實驗，作者證實在shEZH2-NB-39-nu細胞中NTRK1的表達上調（圖2）。

Fig. 2 EZH2 depletion induces NTRK1

        采用shEZH2慢病毒感染其他NB細胞系（NGP、SK-N-DZ和TGW）后，qPCR檢測到NTRK1的表達上調，且NB細胞分化相關基因的表達也上調，顯微鏡下觀察到細胞的神經突觸延伸，進一步驗證了在NB-39-nu細胞中獲得的結果。以上數據表明EZH2是NB細胞分化的重要調控因子之一，且NTRK1是其靶標基因（圖3）。

Fig. 3 EZH2 depletion promotes differentiation and induces NTRK1 in NB cells

 

 

3 EZH2甲基化酶抑制劑誘導NB細胞分化

        為了驗證EZH2小分子抑制劑是否具有類似EZH2 KD的效果，作者使用兩種阻礙EZH2 H3K27甲基化但不會影響的其表達水平的抑制劑處理NB細胞，發現處理后的細胞中NTRK1的表達也受到誘導。但是抑制劑處理后對細胞神經突觸延伸的影響較EZH2 KD輕微，表明EZH2在NB細胞去分化中的作用并不完全依賴于其甲基化活性（圖4）。

Fig. 4 Treatments with EZH2 inhibitors induce NTRK1 expression

 

4 NTRK1促進EZH2調控的NB細胞分化

        為了確定NTRK1是否有助于EZH2調控NB細胞分化，作者使用小干擾RNA來抑制shEZH2-NB細胞中NTRK1的表達。結果表明，NTRK1的敲低顯著抑制了EZH2 KD誘導的NB細胞軸突延伸。而使用神經生長因子處理shEZH2-NB細胞后，軸突的延伸和神經元細胞分化標記蛋白的表達均增加，說明NTRK1能夠促進EZH2調控的NB細胞分化（圖5）。

Fig. 5 EZH2 KD-induced neurite extension is canceled by the depletion of NTRK1

 

5 NTRK1的轉錄受到EZH2和DNA甲基化的調控

        盡管已有的研究表明EZH2可通過其H3K27三甲基化活性導致基因沉默，但目前仍不清楚NTRK1的轉錄是否受EZH2的H3K27三甲基化調節。ChIP-qPCR實驗表明EZH2能夠與NTRK1的P1啟動子區域特異性結合，而EZH2的敲低則顯著降低了NTRK1 P1啟動子區域的H3K27me3標記，使用EZH2甲基化酶抑制劑處理后也得到了類似的結果，表明EZH2通過與NTRK1的P1啟動子區域結合，來直接調控NB細胞中NTRK1的轉錄（圖6）。

Fig. 6 Complex epigenetic regulation of NTRK1 promoters by EZH2 and/or DNA methylation

 

文章小結：

本研究結果表明EZH2在預防NB細胞分化中發揮重要作用，且EZH2相關的NTRK1轉錄調控可能是NB細胞分化的關鍵途徑，本文作者首次在NB細胞中證明了EZH2對NTRK1的表觀遺傳學調控。

 

解析文獻：

Li Z1, Takenobu H, Setyawati AN, et al. EZH2 regulates neuroblastoma cell differentiation via

NTRK1 promoter epigenetic modifications. Oncogene. 2018;doi:10.1038.

 

參考文獻：

Westermann F, Schwab M. Genetic parameters of neuroblastomas. Cancer Lett. 2002;184:127-47.

Peifer M, Hertwig F, Roels F, Dreidax D, Gartlgruber M, Menon R, et al. Telomerase activation by genomic rearrangements in high-risk neuroblastoma. Nature. 2015;526:700-4.

Pugh TJ, Morozova O, Attiyeh EF, Asgharzadeh S, Wei JS, Auclair D, et al. The genetic landscape of high-risk neuroblastoma. Nat Genet. 2013;45:279-84.

Kamijo T, Nakagawara A. Molecular and genetic bases of neuroblastoma. Int J Clin Oncol. 2002;17:190-5.

Teitz T, Wei T, Valentine MB, Vanin EF, Grenet J, Valentine VA, et al. Caspase 8 is deleted or silenced preferentially in childhood neuroblastomas with amplification of MYCN. Nat Med. 2000;6:529-35.