題目：A proteomic atlas of the legume Medicago truncatula and its nitrogen-fixing endosymbiont Sinorhizobium meliloti

豆科植物苜蓿和其共生的固氮根瘤菌的蛋白質(zhì)組學(xué)研究

期刊：Nature Biotechnology

影響因子：35.724

主要技術(shù)：Label free，TMT，修飾蛋白質(zhì)組學(xué)

 

研究背景

        豆科植物和共生的根瘤菌發(fā)生固氮作用可以從空氣中獲得氮，減少植物對土壤肥料的需求。為了進(jìn)一步研究豆科植物與根瘤菌之間的共生關(guān)系，作者利用定量蛋白質(zhì)組學(xué)和修飾組學(xué)，深入研究分析苜蓿與根瘤菌的蛋白表達(dá)譜，揭示蛋白質(zhì)翻譯后修飾在共生關(guān)系中的重要作用。
 

研究內(nèi)容及結(jié)果

1. 蒺藜苜蓿及苜蓿中華根瘤菌蛋白質(zhì)組學(xué)和翻譯后修飾組學(xué)鑒定結(jié)果

        作者為了研究蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）的綜合蛋白質(zhì)組學(xué)，選擇了七個(gè)主要器官：根、莖、葉、花、種子、頂端分生組織（芽）、不同發(fā)育階段的根瘤，分別取樣后進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析（label free 和PTMs）（圖1）。隨后，作者又整合、構(gòu)建了苜蓿的非冗余蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫（Wisconsin Medicago Group，WMG）用于搜庫檢索。為了確定部分蛋白是來自根瘤菌還是苜蓿，作者又將根瘤菌的UniProt數(shù)據(jù)庫和WMG數(shù)據(jù)庫整合在一起，進(jìn)行搜庫分析。在本次研究中，總共鑒定到23013個(gè)蛋白，其中苜蓿19679個(gè)，根瘤菌3334個(gè)，修飾蛋白組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)20120個(gè)磷酸化位點(diǎn)和734個(gè)乙酰化位點(diǎn)。

圖1 蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2. 蛋白質(zhì)表達(dá)譜分析

        為了研究苜蓿全局蛋白表達(dá)情況，作者進(jìn)行了環(huán)形蛋白質(zhì)組學(xué)圖譜分析（CPM，圖2）。發(fā)現(xiàn)有一批核心蛋白質(zhì)（5701個(gè)蛋白）在苜蓿所有部位均表達(dá)（圖2a黑色直方圖，圖3a），翻譯后修飾位點(diǎn)也較為集中于這些核心蛋白質(zhì)組，它們主要參與蛋白質(zhì)折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)、翻譯、糖酵解、糖異生等（圖3b）。而且這批核心蛋白在各個(gè)器官中的表達(dá)也具有相似性（圖3c）。 除此之外，在根瘤所有時(shí)間節(jié)點(diǎn)都表達(dá)的蛋白共有2831個(gè)（圖2b）。

圖2 環(huán)形蛋白組學(xué)圖譜

 

圖3 不同器官的蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果

 

3. 核心蛋白質(zhì)組的翻譯后修飾

        作者進(jìn)一步研究了不同器官蛋白的翻譯后修飾，發(fā)現(xiàn)翻譯后修飾位點(diǎn)也較為集中于這些核心蛋白質(zhì)組，比如根瘤中。細(xì)菌依靠宿主植物提供有機(jī)酸（主要是蘋果酸），以產(chǎn)生固定大氣氮所需的ATP，而在核心蛋白質(zhì)組中，蘋果酸脫氫酶磷酸化水平增加，表明在結(jié)節(jié)成熟過程中磷酸化具有調(diào)節(jié)作用。此外，作者在固氮過程中nifH、Ferredoxin III、nifX等細(xì)菌蛋白發(fā)生了磷酸化修飾，并且固氮酶α鏈和nifH等蛋白發(fā)生了乙酰化修飾。這些關(guān)鍵蛋白的翻譯后修飾可能在固氮調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。

圖4  PTMs 統(tǒng)計(jì)分析

 

4. M. truncatula 蛋白質(zhì)功能分析及構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)

        作者利用方差分析、層次聚類以及基因本體富集分析進(jìn)行蛋白質(zhì)共表達(dá)、修飾共調(diào)控的機(jī)制研究，結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域和序列分析實(shí)現(xiàn)了幾種未表征的蛋白質(zhì)和預(yù)測的基因產(chǎn)物假定功能注釋（圖5）。作者進(jìn)一步用統(tǒng)計(jì)分析火山圖揭示根瘤生長過程相關(guān)蛋白差異表達(dá)，這些蛋白的磷酸化修飾也發(fā)生了改變（圖6a）。為了研究共生關(guān)系中發(fā)揮重要作用的蛋白，作者對根瘤組織中差異蛋白繼續(xù)進(jìn)行分析，利用已有的轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)構(gòu)建了共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。作者發(fā)現(xiàn)，絲氨酸激酶和細(xì)胞壁相關(guān)激酶是共生網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要作用的蛋白，鈣調(diào)蛋白具有最高的連通程度，是宿主中關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子（圖6）。

圖5 M. truncatula蛋白功能注釋

 

圖6 差異蛋白火山圖和蛋白網(wǎng)絡(luò)調(diào)控預(yù)測分析

 

        作者隨后對鑒定到的252個(gè)結(jié)瘤特異性的富半胱氨酸肽（NCR）在根瘤發(fā)育過程中的表達(dá)模式進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，研究發(fā)現(xiàn)NCR多肽在結(jié)瘤過程中發(fā)揮重要功能：早期能夠調(diào)控根瘤形態(tài)發(fā)生，后期可以調(diào)控共生體形成（圖7a）。為了研究這些NCR多肽的靶點(diǎn)，作者接下來分析了S. meliloti蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果，研究發(fā)現(xiàn)，NCR多肽可靶向調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子（AraC、RpiR、LysR、TetR、GntR、LuxR）的特定蛋白質(zhì)家族、與細(xì)胞分裂相關(guān)的蛋白質(zhì)（FtsZ，F(xiàn)tsW）和RNA聚合酶輔助因子（圖7b）。

圖7  NCR表達(dá)模式及網(wǎng)絡(luò)互作分析

5. 其他植物多肽和信號肽酶

        除了上述NCR肽之外，作者還鑒定到了許多的短肽（<20個(gè)氨基酸），這些肽可能在發(fā)育、細(xì)胞-細(xì)胞通訊、免疫反應(yīng)和共生中具有關(guān)鍵作用。同時(shí)，作者研究定位到兩個(gè)信號肽酶（DNF1、a signal peptide peptidase-like protein）和兩個(gè)關(guān)鍵肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（MtN21、PTR1）。作者認(rèn)為深入研究這些多肽將有助于解析共生固氮的機(jī)理。

 

文章小結(jié)

作者在已有的苜蓿基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上對苜蓿大部分器官（根、莖、葉、花、種子、頂端分生組織以及不同發(fā)育階段的根瘤）進(jìn)行蛋白質(zhì)組和修飾蛋白質(zhì)組分析。研究鑒定到了苜蓿核心蛋白質(zhì)組和參與根瘤生長及調(diào)控的特異蛋白子集，建立共生固氮調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)核心蛋白，為分析苜蓿與固氮根瘤菌的蛋白表達(dá)和蛋白翻譯后修飾提供了新的研究思路，推動了根瘤固氮機(jī)理的研究。

 

解析文獻(xiàn)

Marx H, Minogue CE , et al. A proteomic atlas of the legume Medicago truncatula and its nitrogen-fixing endosymbiont Sinorhizobium meliloti. Nature Biotechnology, 2016 , 34 (11) :1198

 

參考文獻(xiàn)

1. Wenger, C.D., Phanstiel, D.H., et al. COMPASS:a suite of pre- and post-search proteomics software tools for OMSSA. Proteomics, 2011, 11, 1064–1074 .

2. Marx, H., Lemeer, S., et al. MScDB: a mass spectrometry-centric protein sequence database for proteomics. J. Proteome Res. 2013, 12, 2386–2398.

3. Cox, J. et al. Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ. Mol. Cell. Proteomics, 2014, 13, 2513–2526 .

4. Tyanova, S. et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nat. Methods, 2016, 13, 731–740.