對于做分子實驗的人來說，探針引物，一個很熟悉的詞語，科研人員也會經常用到，但是對于探針引物的設計，您知道多少？今天，我們就簡單的談下這種引物的設計。

通用原則

1. 先選擇好探針，然后設計引物使其盡可能的靠近于探針；

2. 擴增子的長度應不超過400bp，理想的最好能在100－150bp內，擴增片斷越短，有效的擴增反應就越容易獲得，較短的擴增片斷也容易保證分析的一致性；

3. 保持GC含量在20％和80％之間，GC富含區容易產生非特異反應，從而會導致擴增效率的降低，及在SG分析中非特異信號；

4. 為了保證效率和重復性，應避免重復的核苷酸序列，尤其是G（不能有4個連續的G）；

5. 將引物和探針互相進行配對檢測，以避免二聚體和發卡結構的形成。

 

探針設計指導

1. 在設計引物之前設計探針；

2. 探針的Tm值應在68－70℃之間，如果是目測探針，則要仔細審查GC富含區；

3. 探針的5’端要避免有鳥氨酸，5’G會有淬滅作用，即使被切割下來這種淬滅作用也還會存在；

4. 選擇C多于G的鏈作探針，G的含量多于C會降低反應效率，這時就應選擇配對的另一條鏈作為探針。

5. 探針應盡可能的短，不要超過30個bp。

6. 檢測探針的DNA折疊和二級結構。

 

引物設計指導

1. 引物的Tm值應在58－60℃之間，這非常重要，因為我們的試驗一般都使用退火溫度為60℃，在這個溫度下，5’核酸外切酶的活性最高。

2. 引物末端（最后5個核苷酸）不能有超過2個的G和C。

3. 將引物盡量接近于探針

 

循環參數

當引物和探針按照上述原則設計好后，循環的參數也就確定了，當經過起始的變性溫度后(根據Tag酶要求設定)，反應要經過95℃，15－20秒，60℃，60秒，對于一些模板，45秒也足夠了，數據在退火時檢測。

 

優化探針和引物的濃度

        對于雙探針反應，通過選擇探針和引物的濃度來優化反應結果，能獲得最低的CT值，以及相對于背景來說熒光值有最高的增長。引物濃度應該在50nM-900nM 范圍內進行優化，探針濃度應該在50－250nM范圍內優。探針的濃度應該從（50，100，250nM）與引物濃度相組合，在Rotor-Gene上進行試驗，選擇最小CT值和最高反應擴增的曲線做后續試驗。

        通常所用的探針和引物濃度分別為250nM 和900nM，絕大多數反應都可以在這個濃度下進行，但為了尋找最佳的濃度，還是應該依照上述的步驟。由于引物溶解溫度預測的差異和多種探針設計程序，因此使用三種退火溫度（58℃，60℃，62℃）對優化是很有用的。引物的濃度也會影響溶解溫度，高的引物濃度會讓溶解溫度提高2度左右。Primer3是個非常有用的軟件，但它不能避免3‘端的G，所以應將3’端的G去除，并觀察探針的退火溫度是否比引物高8－10度。

 

定量數據的分析

分析定量數據主要有兩種基本的方法：絕對定量和相對定量。研究人員應該根據擴增子和試驗目的來決定如何分析定量數據。

 

（1）絕對定量

        絕對定量是將未知樣品與標準曲線相比較進行分析，一般標準品就是一個已知絕對濃度的DNA樣品，關于何種標準品用于標準曲線一直有很多討論，理想的標準品其擴增方式應該是與待測樣品一致得，然而這往往是不可能的。一些人會克隆他們得目的基因，并與未知樣品比較。要注意得是，絕對定量分析的準確性是依靠標準品的準確性得。

        在Rotro-Gene 上可以用幾種方法來分析絕對定量數據。包括標準曲線在內的R值，反應效率都會被呈現出來。也可以從以外的分析中調用標準曲線并讓它與一個標準品相調整，（或重復相同的標準品），這個功能在確定斜率的重復性好與Y截距的基礎上完成。對一個標準曲線來說，一個單獨的標準品就已經足夠了，也可以在不同的通道甚至一個通道內繪制多條標準曲線。

 

（2）相對定量

        相對定量是指兩個或更多的基因互相進行比較，其結果是一個比率，沒有確切的數字被檢測道。一種檢測基因表達相對定量的方法叫“比較CT值法（⊿⊿Ct）”，這種方法可以徹底不需要標準曲線，通過觀察與一個動態相關對照比較的表達水平，從而可以將模板與增加的樣品間進行相對定量。要使這種方法成功，目的及參照的動態范圍應該相類似。相對的一個敏感的方法就是看⊿Ct（相同的起始模板濃度，兩個擴增子的兩個CT值的差異）隨著不同稀釋度的模板有什么變化。如果兩個擴增子的反應效率大致相同，則the plot of log input amount versus ⊿Ct 將是一條水平線（斜率<0.01）。這意味著在初始模板濃度范圍內，兩個擴增子有相同的反應效率。如果檢測發現效率不一致，則應該用標準曲線來對基因表達進行定量，或優化反應獲得一個類似的效率。