題目：Distinct Proteomic, Transcriptomic, and Epigenetic Stress Responses in Dorsal and Ventral Hippocampus

轉錄組和蛋白質組聯合分析研究海馬體不同區域應激反應機制

期刊：Biological Psychiatry

影響因子：11.982

主要技術：轉錄組，蛋白質組

研究背景

        生活中的壓力會導致焦慮、創傷后應激障礙和人類認知障礙。參與急性應激反應的一個關鍵組織是海馬體。急性壓力通過改變海馬體不同區域功能引發不同的應答反應。海馬體的內在組織其長背腹側軸高度保守，背側（前部）海馬（dHC）參與介導空間導航和記憶形成，而腹側（后部）海馬體（vHC）則參與情緒調節。作者為了研究海馬體不同區域壓力應答的分子效應，在已有的轉錄組研究基礎之上，結合正在迅速發展蛋白質組學方法，希望揭示生物學和臨床相關的生物標志物。

 

研究內容及結果

1. dHC和vHC的轉錄組分析

        作者選擇C57BL/6J 雄性小鼠的海馬組織不同區域：背側區域（dHC）、腹側區域（vHC）（n=5）進行轉錄組測序，有超過20％的檢測基因（13902個基因中的3081個）在dHC和vHC之間存在差異表達（p <0.005，log2FC >±0.3）（圖1C）。隨后進行Pathway富集分析，得到幾個顯著富集通路（圖1B）。基于轉錄組數據，作者對前期研究人員的轉錄組結果進行驗證，最后確定了490個具有強差異表達的基因（FC > 2，p <0.005）。為了深入研究海馬體不同區域基因之間的功能相互作用，作者基于已知和預測的蛋白質相互作用網絡創建了基因相互作用網絡，發現dHC和vHC形成不同的基因功能簇（圖2，圖3），dHC主要富集參與谷氨酸能突觸傳遞、長時增強效應、內吞作用以及細胞骨架的調控通路，vHC主要富集神經配體-受體激活、含血清素的神經突觸和氨基丁酸能突觸的通路。

圖1 dHC和vHC之間的轉錄組學和蛋白質組學分析

 

圖2 dHC富集基因網絡互作分析

 

圖3 vHC富集基因網絡互作分析

2. dHC和vHC的蛋白質組學分析

        作者使用SWATH-MS進行蛋白質組定量分析，在本次實驗中，質譜定量到2414種蛋白質，Pearson相關性分析表明重復樣本之間表現出極好的相關性。與轉錄組結果類似，作者發現超過20％的蛋白質（2414個蛋白中的513個）在dHC和vHC之間存在差異表達（p <0.005，log2FC >±0.3）（圖1E）。

        接著將轉錄組數據和蛋白質組數據聯合分析發現，有171個基因在mRNA和蛋白質表達水平均發生了顯著變化（圖1G），其中有151個基因的mRNA和蛋白質表達呈正相關（r =0.56, n = 171，p ＜0.0001)（圖1H），有37個基因在vHC中富集，114個在dHC富集。通路分析顯示dHC中富集的mRNA /蛋白質對主要參與鈣信號通路以及谷氨酸能突觸傳遞，vHC中富集的mRNA /蛋白質對主要參與代謝調控。在高富集的mRNA/蛋白質對中，作者發現了Wfs1和Epha7這個兩個基因，它們已被證實富含于海馬CA1神經元中，這說明蛋白質組學分析能夠解決異質性腦切除中亞區域特異性表達差異。此外，作者選擇在dHC中高富集的MOG（myelin oligodendrocyte glycoprotein）進行WB驗證實驗，實驗結果和組學結果一致（圖4）。

圖4 WB驗證實驗結果

3. 不同壓力誘導下轉錄組表達差異

        鑒于在dHC和vHC之間觀察到的顯著分子差異，作者假設應激刺激將在兩種海馬體區域中引起不同的分子反應。于是，作者將小鼠暴露于三種常見的應激之中（新奇感應激、束縛應激、冷水游泳應激），并和籠養對照小鼠一起處死，收集海馬體組織，即海馬體整個組織（HC）、dHC、vHC，進行轉錄組測序，發現大約100個基因對HC中的每個脅迫條件均有強烈表達量反應（p <0.005，log2FC >±0.3），且多數基因表達上調（圖5B）。一個意想不到的發現是，三種壓力因素導致了不同的基因表達譜，在整個HC、dHC和vHC中，每個應激源獨特調節的基因數量遠遠大于交集基因的數量（圖5C-E）。作者將3個刺激中至少響應2種刺激的基因稱為應激基因，通路分析結果表明，上調的應激基因與轉錄調控相關，下調的應激基因與細胞粘附以及細胞連接相關。

圖5  HC、dHC、vHC的壓力誘導下轉錄組學變化

 

        轉錄組學分析表明，vHC對應激誘導的變化較dHC更加敏感，vHC組的應激基因更多，隨后作者繼續研究蛋白質組水平上是否也能觀察到vHC的應激敏感性增加的現象。因為冷水游泳應激總體上誘導了最強的基因表達變化，特別是在vHC中（圖5F），并且蛋白質水平變化比mRNA水平更慢，因此作者決定在冷水游泳應激暴露后24小時測量蛋白質水平。結果發現，同轉錄組的表達趨勢一致，vHC的高應力敏感性仍然可以在蛋白質組水平上檢測到。

 

4. 蛋白互作網絡分析

        為了更好地理解dHC和vHC中應激差異調節的分子網絡和過程，作者進行PPI互作網絡分析。結果表明，與dHC相比，在vHC觀察到更大的相互作用網絡（圖6A，6B），其特有表觀遺傳學簇Kdm6b（特異性抑制組蛋白H3K27me3的組蛋白去甲基化酶）響應vHC中的所有壓力因素（圖6C-E）。WB檢測冷水游泳應激后H3K27me3的水平，發現 dHC中H3K27me3表達水平不變，而vHC中H3K27me3表達明顯下調（圖6F，6G）。

        為了研究體內vHC中Kdm6b的敲低是否會對行為產生影響，作者對腹部海馬區的Kdm6b進行RNAi干擾（shRNAs-Kdm6b）。手術后4周，在vHC中證實了病毒表達（圖6J），而在dHC中沒有病毒表達（圖6I，6J）。與對照小鼠相比，shRNAs-Kdm6b小鼠vHC全組織裂解物中的Kdm6b mRNA水平降低（圖6L），運動時更容易激動，過度活躍。這表明vHC神經元中的Kdm6b似乎對維持意外刺激的正常行為反應至關重要。

圖6 vHC的應激反應表觀遺傳網絡

文章小結

        海馬體的dHC和vHC兩個區域具有不同的壓力應答分子反應，并且vHC對壓力的刺激響應更加敏感。單獨分析海馬體不同區域大大提高了檢測應力誘導變化的靈敏度。此外蛋白質互作網絡分析揭示了限制于vHC的組蛋白去甲基化酶Kdm6b周圍的應激反應表觀遺傳網絡，并且急性應激降低了其酶靶H3K27me3的甲基化，vHC中選擇性Kdm6b敲低可導致小鼠行為過度活躍。這些發現強調了在進行高通量分子分析時分別考慮背側和腹側海馬的重要性，對基礎研究和臨床研究具有重要意義。

 

解析文獻

Floriou-Servou A, von Ziegler L, et al. Distinct Proteomic, Transcriptomic, and Epigenetic Stress Responses in Dorsal and Ventral Hippocampus. Biological Psychiatry, 2018, 84(7):531-541

 

參考文獻

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4. Szklarczyk D, Morris JH, et al. The STRING database in 2017: Quality-controlled protein–protein association networks, made broadly accessible. Nucleic Acids Res, 2017, 45:D362–D368.