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菌落PCR步驟詳解及注意事項(xiàng)

信息來源：金開瑞作者：genecreate 發(fā)布時(shí)間：2022-11-01 10:31:48

菌落PCR（colony PCR）, 是一種快速、高通量篩選目的片段是否存在的方法，操作起來十分簡單。篩選目的是為了得到含有目的片段的菌株進(jìn)行測序，提高效率。以大腸桿菌為例，一般來說，在轉(zhuǎn)化了攜帶外源基因的質(zhì)粒后，需要檢查并確保所設(shè)計(jì)的質(zhì)粒確實(shí)已經(jīng)存在于細(xì)胞中了；那么，面對(duì)一整板的菌落，如何才能知道哪個(gè)小細(xì)菌攜帶了目標(biāo)片段并且是完全準(zhǔn)確的目的片段呢？

按照一般的步驟，可以把每個(gè)菌落挑出來進(jìn)行培養(yǎng)提取質(zhì)粒，然后質(zhì)粒進(jìn)行測序或者酶切驗(yàn)證目的片段。但是從培養(yǎng)細(xì)菌到最后送測序，花費(fèi)太多時(shí)間。如果說只有一個(gè)菌落去驗(yàn)證，那工作量倒不是很大；萬一有100個(gè)菌落，怎么辦呢？那么，我們就可以進(jìn)行菌落PCR篩選。

基本步驟

1. 單菌落挑取

把LB培養(yǎng)基倒入排槍槽中，然后用排槍加400μL LB培養(yǎng)基到48孔深孔板，用鑷子拿已滅菌的小白槍頭挑取平板上的單菌落并放到48孔深孔板中，同時(shí)在48孔深孔板和相應(yīng)的表單上做好記錄，注意對(duì)于藍(lán)白斑篩選的板子要挑的是白斑。挑好的48孔深孔板用封口膜蓋好并做好相應(yīng)標(biāo)記（日期、板號(hào)等），用針頭在封口膜打孔，把它放在37℃搖床上搖一個(gè)小時(shí)。

2. 菌落PCR反應(yīng)

配置好PCR反應(yīng)的反應(yīng)體系，把配好的反應(yīng)液加到 96孔反應(yīng)板中，用排槍加2.5μL的菌液到其中，注意在96孔反應(yīng)板上做好標(biāo)記。把96孔反應(yīng)板放在PCR儀器上蓋好橡膠墊，按照PCR反應(yīng)條件設(shè)置反應(yīng)程序，注意一定要把PCR儀器的蓋子蓋緊。

3. 瓊脂糖凝膠電泳

一般先配置1.0%-1.2%瓊脂糖凝膠（即稱1.2g的瓊脂糖加100ml的TAE），在96孔反應(yīng)板每個(gè)管中加0.5μL的溴酚藍(lán)，震蕩均勻，然后點(diǎn)樣，電泳好的瓊脂糖凝膠拍照，命名保存。

4. 判斷陽性克隆并測序

根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳圖條帶來判斷陽性克隆，把陽性克隆的菌液進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，進(jìn)行測序驗(yàn)證，看看是否有完全正確的序列。

注意事項(xiàng)

1. 對(duì)于要求篩選出插入片段方向的。

首先我們要大量的挑選陽性克隆，然后根據(jù)具體情況，挑選合適的引物配反應(yīng)液。

2. 怎樣來篩選高GC的序列？

如果是GC含量有起伏的序列，可以避開高GC區(qū)域來篩選。如果無法避開，首先要選擇序列上面的引物，并針對(duì)性的變換，使反應(yīng)條件按照高GC方案來單獨(dú)上PCR反應(yīng)。

3.挑斑操作時(shí)應(yīng)該注意什么？

挑斑時(shí)槍頭深淺要掌握好，菌體盡量多的粘到槍頭上，如果斑太小的話最好繼續(xù)培養(yǎng)一段時(shí)間，盡量挑選表面光滑、有光澤、半透明、扁平微凸的斑。

4. 陽性對(duì)照和陰性對(duì)照在菌落PCR中的好處

陽性對(duì)照：篩選某一序列時(shí)，加入一個(gè)已知含有目的序列的質(zhì)粒做對(duì)照，可以證明反應(yīng)的體系和反應(yīng)程序的正確性。如果沒有檢到條帶，可以排除以上因素。

陰性對(duì)照：在一管反應(yīng)體系中刻意的不加模板，結(jié)果應(yīng)該是沒有條帶。如果出現(xiàn)條帶，證明體系中有成分受污染。

5.在查看瓊脂糖凝膠電泳圖時(shí)，發(fā)現(xiàn)大小不對(duì)的條帶，是什么情況，如何來解決？

一般有如下幾種情況及解決方案：

①如果是用載體引物來進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可能是空載體，引物產(chǎn)生了錯(cuò)配，用來做克隆的PCR產(chǎn)物大小不對(duì)。

解決方案：如果是空載體，重新酶切載體再次進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化；如果是引物錯(cuò)配，對(duì)序列進(jìn)行分析，換一對(duì)合適的引物；如果PCR產(chǎn)物大小不對(duì)，重新進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用正確大小的產(chǎn)物進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化。

②如果是用序列上面的引物來進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可能原因是引物錯(cuò)配，用來做克隆的PCR產(chǎn)物有缺失或者多一段。

解決方案：如果是引物錯(cuò)配，對(duì)序列進(jìn)行分析，換一對(duì)合適的引物；如果PCR產(chǎn)物有缺失或者多一段，重新進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用正確大小的產(chǎn)物進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化。

③電泳跑膠問題，在用不同的染料進(jìn)行電泳時(shí)，有時(shí)候?qū)α繘]有把握好，很容易出現(xiàn)這種問題。

解決方案：跑完P(guān)CR的反應(yīng)液，重新加合適比例的染料，來進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。

6. 在查看瓊脂糖凝膠電泳圖時(shí)，發(fā)現(xiàn)沒有帶，是什么原因，如何來解決？

通常有以下幾種情況及解決方案：

①配置的PCR反應(yīng)體系有問題

解決方案：首先檢查下篩選用的引物是否正確，再通過陽性對(duì)照來檢驗(yàn)下整個(gè)體系是否有問題，重新配置反應(yīng)體系來篩選。

②序列有結(jié)構(gòu)導(dǎo)致無帶，比如高GC、發(fā)夾結(jié)構(gòu)

解決方案：在確保反應(yīng)體系沒有問題的前提下，可以挑選幾個(gè)無帶的克隆進(jìn)行培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒，選擇合適位點(diǎn)進(jìn)行酶切驗(yàn)證。

③空載體的情況下，用序列上面的引物進(jìn)行篩選，也是無帶

解決方案：用載體上面的引物再進(jìn)行一次篩選，來確定是否為空載體，同時(shí)重切載體，進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化。

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