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重組蛋白包涵體究竟是什么？

信息來源：金開瑞作者：genecreate 發布時間：2019-01-05 15:53:44

包涵體定義

重組蛋白在宿主系統中高水平表達時，很容易形成不可溶、無生物活性的蛋白聚集體--包涵體。包涵體須經過變性溶解后，在適當條件下復性形成天然的構象，才能得到生物活性蛋白，其生物活性得到恢復。

目前，大腸桿菌表達系統是生產重組蛋白最常用的表達體系，其重組蛋白的表達量可達細胞蛋白的50%，其他成分主要有一些雜蛋白（如 RNA聚合酶、核糖體組分、外膜蛋白等）、質粒 DNA、RNA 片斷和脂質、肽聚糖、脂多糖等成分。

然而，重組蛋白的高表達往往導致形成高密度、不溶性蛋白顆粒，即沒有生物活性的包涵體，需經過復性后方可恢復蛋白的生物學活性。

包涵體特點

包涵體一般含有50%以上的重組蛋白，其余為核糖體元件、RNA聚合酶、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，環狀或缺口的質粒DNA，以及脂體、脂多糖等，大小為0.5-1um，難溶于水，只溶于變性劑如尿素、鹽酸胍等。

包涵體形成原因

通常情況下認為，包涵體的形成主要有以下幾方面原因：

（1）宿主的代謝水平會受到重組蛋白高表達的影響，蛋白沒有足夠的時間進行折疊；

（2）二硫鍵的形成受到宿主細胞內環境的影響，或者因為二硫鍵不能正確配對，過多的蛋白間的非特異性結合，蛋白質無法達到足夠的溶解度；

（3）重組蛋白的氨基酸組成有差異。一般來看，含硫氨基酸和脯氨酸的含量都與包涵體的形成呈明顯的正相關；

（4）環境因素，如重組蛋白所處的環境溫度、培養基的成分、酸堿度、離子強度等都可影響包涵體的形成，有研究發現，溫度與包涵體形成呈正相關，培養基養分不足時，包涵體也容易形成；

（5）重組蛋白在真核生物中翻譯后修飾需要相關酶類（如糖基化等），但因其是大腸桿菌的異源蛋白，缺少這種酶類，造成積累大量的中間體，從而形成包涵體沉淀；

（6）細菌分泌的某個階段，蛋白質分子間的化學作用促使包涵體形成。

包涵體變性

在包涵體中，重組蛋白處于錯誤折疊的狀態，二硫鍵大部分也是錯搭的，它們之間的聚集靠非共價鍵維持，包括疏水力、范德華力、氫鍵、靜電引力等，唯一的共價鍵是半胱氨酸之間的二硫鍵。常用5-6mol/L的鹽酸胍或 5-8mol/L的尿素。

尿素和鹽酸胍對蛋白質的變性作用符合Hofmeister規則。要獲得正確折疊的蛋白首先是溶解包涵體，使蛋白變性，變性即破壞非共價鍵，并用還原劑（如β-巰基乙醇或二硫蘇糖醇）打開二硫鍵。

然而，尿素中的異氰酸鹽或酯會引起蛋白質中氨基或巰基的不可逆修飾，而鹽酸胍是一種離子型變性劑，它會影響下游的離子交換純化。但是，鹽酸胍的變性能力是尿素的 1.5-2.5倍。

有實驗表明，在IL-4的變復性過程中，用尿素時蛋白質很難恢復活性，而用鹽酸胍來溶解包涵體，可以提高蛋白質的復性率。

包涵體復性方法

復性是指通過去除變性劑使目標蛋白從完全伸展的變性狀態恢復到正常的折疊結構，同時去除還原劑確保二硫鍵正常形成。

除去變性劑及還原劑，給變性的蛋白分子提供正確的再折疊及恢復活性的環境，可以獲得天然的活性蛋白。應用最普遍的再折疊方法有透析、稀釋、超濾等。

（1）將變性蛋白直接稀釋于復性液中的復性方法稱為稀釋復性。這種復性方法最簡單、有效。稀釋復性很容易操作、放大和操控，所以在生物醫藥行業和科學研究領域被廣泛運用。

稀釋復性的蛋白終濃度一般控制0.01mg/ml以下，這是為了防止形成大量的蛋白沉淀和提高可溶性收率。

（2）透析復性是實驗室中常用的一種方法，但耗時長，容易形成沒有活性的蛋白質聚集體。主要包括一步透析和多步透析兩種，最常采用的是多步透析。

透析過程中，通過逐步降低外部復性液中變性劑的濃度，使透析袋內部變性劑的濃度也逐漸降低。與稀釋復性相比，這種方法能夠在一定程度上提高蛋白質的復性效率。

（3）在高濃度蛋白條件下進行包涵體復性時，常使用外加壓力差，加速變性劑去除的超濾復性法。超濾復性是選擇合適載留分子量的膜，允許變性劑通過膜而蛋白質通不過，伴隨變性劑除去，以相同的速度加入復性液，蛋白濃度保持不變。

超濾復性具有規模大，耗時少的特點，這種方法較稀釋和透析的方法耗時顯著減少，因此比較適合工業化生產中應用。

但有些蛋白可能在應用此法復性時，發生不可逆的變性，所以在樣品量較少的情況下不推薦使用超濾復性。

包涵體蛋白復性過程

包涵體復性原則

低濃度，平緩梯度，低溫。

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