首頁集團(tuán)概況技術(shù)專題

microRNA實(shí)驗(yàn)方法

信息來源：金開瑞作者：genecreate 發(fā)布時(shí)間：2019-01-16 11:12:36

一、概觀miRNA

MicroRNAs（miRNAs）是一類非編碼的小RNA分子，通過與靶RNA的3´UTR互補(bǔ)或部分互補(bǔ)結(jié)合，使其降解或介導(dǎo)其翻譯抑制，參與細(xì)胞增殖、凋亡、分化、代謝、發(fā)育、腫瘤轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)過程。miRNAs及其衍生物在疾病診斷和治療有很大的前景。 miRNAs基因通常位于基因間或編碼蛋白基因的內(nèi)含子中，在核內(nèi)由RNA聚合酶II或III轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生具有特征性莖環(huán)結(jié)構(gòu)的pri-miRNA，然后在Drosha-DGCR8復(fù)合體的作用下，剪接成70nt的pre-miRNA，它由exportin5由核內(nèi)運(yùn)到胞漿。在胞漿內(nèi)，pre-miRNA在Dicer酶作用下剪切成22bp的成熟雙鏈miRNA，其中的一條鏈與RISC結(jié)合而參與基因轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控。

miRBase數(shù)據(jù)庫第21版里列有來自223物種的28645莖環(huán)結(jié)構(gòu)和35828成熟miRNAs。可能近90%的人類基因受到miRNAs調(diào)控，然而，當(dāng)過表達(dá)或抑制某一個(gè)miRNA時(shí)，在發(fā)生調(diào)變的眾多基因當(dāng)中尋找并鑒定其中起關(guān)鍵作用的靶基因仍然具有相當(dāng)大的挑戰(zhàn)。目前鑒定miRNA靶基因的常用策略是利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測，結(jié)合基因芯片分析以及生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法來研究miRNA的功能及尋找其中起重要作用的靶基因。此外，利用蛋白質(zhì)質(zhì)譜來尋找miRNA靶基因也成為一種新的途徑。

二、miRNA的檢測和定量

為了驗(yàn)證miRNA在組織細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，目前常用來檢測miRNA的技術(shù)主要有以下幾種：Northern雜交，原位雜交， Stem-loop實(shí)時(shí)定量RT－PCR。這三種技術(shù)各有利弊，可以相互結(jié)合應(yīng)用，來反映細(xì)胞內(nèi)miRNA的真實(shí)表達(dá)水平。

Northern雜交

MicroRNA是一類很小的分子，部分microRNA表達(dá)水平可能很低，因而需要極為靈敏而定量的分析工具。由于其分子很小，用RT-PCR的方法來定量研究有一定困難，特別是重復(fù)性較差，步驟繁瑣等。目前多數(shù)研究人員采用Northern Blot，它是一種重復(fù)性好、靈敏高、直接的方法,可以用來檢測microRNA的存在、表達(dá)量的變化等。而由于放射污染等原因，同位素標(biāo)記的探針的使用有一定的局限性。而Exiqon公司推出的鎖核苷酸（locked-nucleic acid, LNA）探針，具有穩(wěn)定性高、特異性好、無放射污染等優(yōu)點(diǎn)，成為新的Northern Blot檢測探針。

Northern雜交表明從人類和小鼠來的前miR-499和成熟miR-499條帶

基本原理

將待檢測的RNA分子變性后，通過尿素變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離,繼而按其在凝膠中的位置轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，固定后再與同位素、地高辛或其它標(biāo)記物標(biāo)記的DNA或RNA探針進(jìn)行反應(yīng)。如果待檢物中含有與探針互補(bǔ)的序列，則二者通過堿基互補(bǔ)的原理進(jìn)行結(jié)合，游離探針洗滌后用自顯影或其它合適的技術(shù)進(jìn)行檢測，從而顯示出待檢的片段及其相對大小。

用途

檢測樣品中的RNA及其含量，了解基因的狀態(tài), 如是否有點(diǎn)突變、擴(kuò)增重排等。

實(shí)驗(yàn)過程

1.提前配制無APS和TEMED的15%的Ura-PAGE膠的混合液，即50ml of Pre-Gels：

Urea: 24 g

40% Acrylamide: 18.75 mL

5x TBE Buffer: 10 mL

ddH20: 0 mL

2.器皿的清洗：器皿同Western Blotting裝置。

用清水沖洗干凈，乙醇擦干3%；

H2O2 填充浸泡電泳槽、玻璃片、梳子10分鐘；

用0.1% DEPC處理過的水沖洗電泳槽，梳子和玻璃片。

用RNAase Away 擦海綿和其他相關(guān)器材。

安裝配膠裝置。

3.配膠：取10 ml Pre-Gels，加入33.3- 45 ul的APS 和 10-20ul的TEMED，混勻，加入玻片中，加入10或15齒梳子。大約30-60 min 即可凝好。

4.RNA樣品的準(zhǔn)備 Small RNAs（大約107細(xì)胞）（或者Total RNA ~20-200ug）在 ~18ul DEPC H2O 加入 2ul 10xRNA loading buffer。 95℃加熱 5min, 冰上冷卻。瞬時(shí)離心收集RNA樣品。

5.電泳：（裝置同Western Blotting電泳裝置），電泳液1xTBE。15% Urea-PAGE 在電泳液 1xTBE進(jìn)行電泳。電壓180V 直到溴芬蘭到達(dá)膠的底部。根據(jù)Ambion公司的步驟，在上樣之前，300V 預(yù)電泳10min（防止膠漏同時(shí)活化膠），然后用電泳液1xTBE沖洗孔，將尿素沖出后然后小心、迅速加樣。選用的是Roche公司提供的LNA-labeled DNA作為對照，同時(shí)將自己合成的RNA Oligo作為陽性對照（總量為1 pmol即可）。其中溴芬蘭的對應(yīng)的分子量為13nt左右，二甲苯青FF對應(yīng)的為40 nt左右。

6.轉(zhuǎn)膜（裝置同Western Blotting轉(zhuǎn)膜裝置），轉(zhuǎn)膜液為0.5ⅹTBE。

將膠浸泡在0.5ⅹTBE大約 10min 。

用EtBr （0.5ug/ml）染膠10min 后，用紫外凝膠觀測RNA電泳情況（參考Ambion公司的條帶分析）。用0.5ⅹTBE 洗膠 5min.

用鉛筆標(biāo)記好轉(zhuǎn)膜的面，將 Nylon membrane（GE公司）和兩片厚濾紙浸泡在 0.5ⅹTBE 大約10min.

制備凝膠、膜夾層。將濾紙、膠、膜、濾紙形成三明治結(jié)構(gòu)，注意膠應(yīng)該靠近陰極側(cè)。注意每層間不能有氣泡。

裝配好轉(zhuǎn)膜裝置，裝置同Western Blotting轉(zhuǎn)膜裝置。

于冰上300mA轉(zhuǎn)膜 1 h。

把膜（RNA 面朝上）放在紫外交聯(lián)儀中使用4000J UV進(jìn)行交聯(lián).

將膜夾在厚的濾紙中間，80℃烘烤0.5-2 h，可以輕壓，以防止膜發(fā)生翻卷。

如果可以直接做，則放在室溫即可；也可以儲存在4ºC ，直到使用（可儲存6個(gè)月）。

亞甲藍(lán)（methylene blue）染色 3~5min, 在可見光下黃色濾光片對膜照相。

7.雜交

在雜交爐中37- 42℃ 在雜交液（7% SDS， 0.2M Na2HPO4）中預(yù)雜交1h , 然后將膜放入雜交袋，然后加入配好濃度的Dig-Labeled probe，在雜交爐中37- 42℃雜交過夜。Dig-Labeled probe使用濃度：將10ul的25uM的公司原液稀釋十倍后分裝儲存，取儲存probe液（2.5uM）20ul/6ml（U6內(nèi)參）或2.7-27ul儲存液/10ml雜交液（根據(jù)miRNA的量或豐度定）。

37- 42℃洗膜液（2×SSC，0.1%SDS）洗膜三次，每次15min。

室溫MABT（0.1M Maleic Acid， 0.15M Nacl，0.3% Tween-20 ，PH7.5）洗膜三次，每次5min。

室溫用Blocking Solution（用MAB 10倍稀釋10×Blocking Solution）封閉 1h 。

室溫加入anti-Dig antibody 40 min（1:10000-1:5000 in Blocking Solution）。注意：抗體用之前，應(yīng)該以12000g速度離心5 min。

用MABT液洗膜兩次，每次15 min。

膜在Detection buffer（ 0.1 M Tris-HCl, 0.1M NaCl, pH 9.5）中平衡5 min。

配CSPD液（1：100 Detection Buffer），有RNA的膜面向上放入雜交袋中，加入1ml 配好的CSPD液，擠出氣泡，封口，孵育5 min。

擠出CSPD液，封口，37℃孵育5-15 min。

曝光2 min~1h（根據(jù)情況定）。一般內(nèi)參U6在5分鐘內(nèi)即可顯影。

實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

配膠時(shí)，由于濃度較大，所以尿素比較難溶，尿素的溶解不能加熱，可以采用振蕩或顛倒離心管；配好的無APS和TEMED的15%的Ura-PAGE膠可以儲存在室溫或4℃冰箱中（可儲存1個(gè)月左右）。

電泳前，應(yīng)該按照步驟將裝置盡量進(jìn)行RNAase free處理。

RNA上樣前，300V 預(yù)電泳10min（防止膠漏，同時(shí)活化膠），然后用電泳液1xTBE沖洗孔，將尿素沖出后然后小心、迅速加樣。此操作需要一定的訓(xùn)練，因?yàn)榧訕涌字泻芸鞎龀瞿蛩兀坏┯心蛩匚龀鰧NA電泳的形態(tài)會有一定的影響。

LNA探針使用前進(jìn)行分裝，然后凍存于-70℃冰箱中。

不同miRNA雜交的溫度和時(shí)間不同，需要進(jìn)行條件的摸索。一般內(nèi)參溫度為42℃。

尼龍膜紫外交聯(lián)和烘烤后，可以在4℃冰箱中保存半年以上。

三、miRNA靶基因的鑒定

由于計(jì)算機(jī)模擬在預(yù)測miRNA靶基因時(shí)存在一定的局限性,利用生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法可以更加直觀地尋找miRNA靶基因.目前主要是從mRNA水平與蛋白質(zhì)水平來尋找靶基因。從mRAN水平來尋找靶基因主要是通來在細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)miRNA后，利用基因芯片分析mRNA的變化以找出相應(yīng)miRNA的靶基因。這種方法由于miRNA所介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后翻譯抑制過程不引起mRNA水平的改變, 因此依據(jù)mRNA水平的變化尋找miRNA靶基因的方法在檢出率上存在一定問題。故采用蛋白質(zhì)質(zhì)譜的方法可以有效彌補(bǔ)這個(gè)不足。同時(shí)再結(jié)合miRNA靶基因的預(yù)測方法，可以大大提高了靶基因的檢出率及可靠性。

目前鑒定靶基因最直接的方法是, 利用熒光定量PCR及Western blot方法分別檢測轉(zhuǎn)染或敲低miRNA后細(xì)胞中mRNA水平及蛋白水平的變化, 從而確定miRNA與靶基因的對應(yīng)關(guān)系。這種方法可以大大提高準(zhǔn)確率，但最終確定靶基因，還需要鑒定miRNA的靶位點(diǎn)。而miRNA的靶位點(diǎn)的鑒定最常用的方法是熒光素酶報(bào)告基因法。其基本原理是首先構(gòu)建熒光素酶表達(dá)載體, 將希望鑒定的miRNA靶基因的3´UTR構(gòu)建到熒光素酶基因的3´UTR中, 然后將熒光素酶基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞并改變細(xì)胞中相應(yīng)miRNA的表達(dá)水平, 最后檢測熒光素酶的表達(dá)情況以分析轉(zhuǎn)染3´UTR中是否含有miRNA的靶位點(diǎn)。

上一條：抗體的結(jié)構(gòu)和片段

下一條：抗體稀釋和抗體滴度解析

最新動態(tài)