免疫印跡實驗步驟及問題解決
信息來源：金開瑞 作者：genecreate 發布時間：2019-01-21 16:43:54
一、實驗步驟
試劑和緩沖液
1x RIPA 緩沖液: 50 mM Tris， 150 mM NaCl， 0.1% SDS， 0.5% SDS， 1% Triton X-100 或NP40.
1x PBS 緩沖液: 137 mM NaCl， 2.7 mM KCl， 2.7 mM Na2HPO4， 2.7 mM KH2PO4， pH 7.4
BCA或Bradford蛋白分析試劑盒
1.5 M Tris緩沖液 （pH 8.8）: 90.68 g Tris-HCl to ddH2O， 500 ml溶液pH調節到8.8
1.0 M Tris緩沖液 （pH 6.8）: 60.58 g Tris-HCl to ddH2O， 500 ml溶液pH調節到6.8
10% APS: 100 mg AP 溶于1 ml ddH2O。 用前準備
10% SDS: 10 g SDS溶于100 ml ddH2O。
1x Tris-甘氨酸電泳緩沖液: 25 mM Tris， 230 mM 甘氨酸 （pH 8.3）， 0.1% SDS。
3x SDS蛋白加樣緩沖液: 150 mM Tris （pH 6.8）， 6% SDS， 30% 甘油， 30 mM EDTA和0.2% 溴酚藍
1x TTBS: 25 mM Tris（pH 7.5）: 0.15 M NaCl， 0.05% Tween-20， 0.001% 硫柳汞
1x 轉移緩沖液: 3 g Tris， 14.4 g甘氨酸和200 ml甲醇，加ddH2O 到1L
樣品準備
細胞培養樣品
貼壁細胞
去除培養基，用1X PBS沖洗去掉殘留培養基
加入預冷的400 ul-1 ml 1X RIPA緩沖液/100 mm平皿。 在冰上孵育5-10 min。
完全刮下細胞并轉移到在冰上預冷的1.5 ml離心管中。
（可選）充分混勻或超聲處理。
4°C下12,000 rpm離心10-15 min并收集上清
總蛋白用前需儲存在-20°C。
懸浮細胞
（可選）取出100 ul細胞培養也進行細胞計數。
將細胞轉移到預冷的1.5 ml或15 ml離心管2000 rpm 4°C離心5 min。
去除培養基并用1 ml預冷的1x PBS重懸細胞，然后轉移到1.5 ml離心管中。
2000 rpm 4°C離心5 min。
用1 ml預冷的RIPA 緩沖液/107細胞重懸細胞
細胞懸液在冰上孵育并搖床30 min，或充分混勻或超聲處理。
4°C 12000 rpm離心10-15 min收集上清備用。
總蛋白需要在用前儲存在-20°C 。
組織
組織準備和定量。將組織切成小塊。
加入500-600 ul預冷的1x RIPA緩沖液/100 mg 組織。
將組織充分混勻
4°C 12000 rpm離心15-20min。
收集上清。
總蛋白在用前應儲存在-20°C。
蛋白定量
Bradford分析和BCA分析請查看來邦的綜述 蛋白定量。
SDS-PAGE
聚丙烯酰胺凝膠
6%-15% 分離膠上注入5%的濃縮膠并插上梳子（10或者15孔）。
| 分離膠濃度（%） | 蛋白大小范圍（kDa） |
| 8 | 25-200 |
| 10 | 15-100 |
| 12.5 | 10-70 |
| 15 | 12-45 |
| 20 | 4-40 |
表1： 蛋白分離范圍由分離膠濃度決定。
上樣和電泳
2X SDS蛋白上樣緩沖液與蛋白樣品1:1充分混勻。
注膠前先將樣品在50-60°C預熱。預染Marker可用于監控蛋白分離和轉移效率。
在1X Tris-甘氨酸緩沖液在60-120V跑電泳1-3小時
| 分離膠（10ml） | 濃縮膠（3ml） | |||||
| 6% | 8% | 10% | 12% | 15% | 6% | |
| H20 | 5.3 | 4.6 | 4.0 | 3.3 | 2.3 | 2.1 |
| 30% 丙烯酰胺混合物* | 2.0 | 2.7 | 3.3 | 4.0 | 5.0 | 0.5 |
| 1.5M Tris（pH 8.8） | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 1.0M Tris （pH 6.8） 0.38 |
| 10% SDS | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.03 |
| 10% APS | 0.1 | 0.1 | 0.1 | .1 | 0.1 | 0.03 |
| TEMED | 0.008 | 0.006 | 0.004 | 0.004 | 0.004 | 0.003 |
表2：分離膠（10ml）和濃縮膠（3ml）的制備方案
蛋白轉移
將蛋白轉移到PVDF或NC*膜上進行抗體檢測
1.將電泳材料，如膠、whatman紙和海綿放入1X轉移緩沖液中預先浸潤.
2.PVDF膜應在甲醇中預先孵育10秒到1分鐘，然后移入轉移緩沖液中
3.將材料按如下順序放置:板（黑色面）， 海綿， Whatman紙， 膠， 膜， Whatman紙， 海綿， 板（亮面）.
4.將轉移裝置安置好，黑色面對應黑色電極。
5.轉移到冷的1X轉移緩沖液中.電轉電流和時間應該根據電泳裝置的廠家說明推薦設置。
* NC膜不能用甲醇孵育。
將膜放入溶有5%脫脂奶粉的1x TBST中25°C孵育1小時 （或在搖床上4°C孵育過夜）。
抗體孵育
1.按照推薦濃度或根據結果優化濃度，將一抗溶于1X TBST+3% BSA中。
2.在4°C孵育過夜或更長時間，或者在室溫下4小時。
3.回收一抗，保存在4°C。然后在室溫下在搖床上沖洗膜三次，每次5-10 min。
4.將二抗放入1X TBST中稀釋，然后室溫下孵育膜1小時，或4°C搖床上2-4小時。
5.在室溫搖床上用TBST洗三次，每次10 min
ECL+ 系統和X-ray膠卷被用于HRP標記的二抗。
二、問題解決
沒有信號，可能原因
檢測的二抗用錯了（明確一抗制備的宿主）
一抗或二抗的濃度太低（提高濃度再試一次）
一抗不能識別檢測物種的蛋白（檢查一抗的特異性）
上樣蛋白量太少（增加樣品的量）
轉移效率太低（改進轉移實驗步驟。確保PVDF膜用之前用甲醇預孵育）
一抗已經被用很多次了（使用重新稀釋的一抗）
封閉時間太長或者洗滌次數太多（減少封閉時間和洗滌次數）
檢測試劑盒失效（加入陽性對照并確保試劑盒有效）
疊氮化鈉可能抑制二抗（溶解緩沖液中應避免使用疊氮化鈉）
一抗或二抗的孵育時間太短（延長孵育時間）
背景太亮
封閉時間太短或者封閉緩沖液有問題（延長封閉時間或者用BSA代替脫脂奶粉）。
一抗或二抗濃度太高。（降低抗體濃度）
洗脫不充分（增加洗脫次數）
孵育溫度太高 （確保一抗在4°C孵育）
膜使用錯誤或者膜已經干了 （避免膜變干）
白色條帶或者信號消失很快
一抗或二抗濃度太高（降低抗體濃度）
條帶彎曲
電泳電壓太高，或者電泳過程中緩沖液溫度太高。（降低電壓，電泳緩沖液置于冷的環境中）
條帶彌散
一抗或二抗濃度太高（降低抗體濃度）
上樣蛋白量太大 （降低上樣量）
空白區域
轉移不均衡（確保膜均衡的貼到膠上，沒有氣泡）
非特異性信號
一抗或二抗濃度太高（降低抗體濃度）
條帶臟或者模糊
平衡時間不夠，或者膠與膜的接觸不均衡。（確保膠沒問題，改進轉移步驟）
禿斑
膠與膜之間有氣泡（確保膠與膜之間沒有氣泡）
條帶大小與理論不符
一抗特異性差（更換一抗）
一些蛋白可能移動與理論大小差別較大。
不能闡釋可能的翻譯后修飾
翻譯后修飾例如多聚（ADP-核糖基）-PAR鏈（它能夠介導蛋白分子帶負電荷）不能通過SDS-PAGE分別。 不過它們能通過CTAB-PAGE分開。 CTAB， 溴化十六烷基三甲基銨 （(C16H33）N(CH3)3Br， cetyltrimethylammonium bromide， hexadecyltrimethylammonium bromide）是一種基于氨陽離子的表面活性劑。
上一條：抗體稀釋和抗體滴度解析
下一條：引物合成的步驟及方法介紹
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