題目：Landscape of submitochondrial protein distribution

線粒體亞細胞器蛋白質(zhì)分布圖譜

期刊：Nature Communications

影響因子：12.353

主要技術(shù)：線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)、SILAC

研究背景

        線粒體是具有雙層膜結(jié)構(gòu)包裹的細胞器，對細胞的能量代謝起著至關(guān)重要的作用。據(jù)估計，酵母和人類分別含有線粒體內(nèi)的蛋白約1000種和1500種，分布在四個不同的子區(qū)室中。目前已有許多對線粒體細胞器蛋白組學(xué)的研究，但是對這些蛋白質(zhì)在細胞器內(nèi)的局部定位沒有明確解析。

 

研究內(nèi)容及結(jié)果

1. 線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)圖譜

        作者選擇釀酒酵母作為研究對象，使用SILAC定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對釀酒酵母線粒體中可溶性蛋白、外周膜蛋白、整合膜蛋白進行鑒定分析（圖1a）。并使用兩種不同的方法對三類線粒體蛋白進行分類：1. 使用pH11.5的碳酸鹽溶液處理，將線粒體分為膜蛋白（沉淀中，PELcarb）和外周膜＋可溶性蛋白（上清中，SNcarb）兩個組分；2. 超聲處理將線粒體分為膜蛋白（包含內(nèi)膜和外周膜蛋白，PELson）和可溶性蛋白（SNson）（圖1b）。結(jié)果共定量1053種不同的蛋白質(zhì)，其中805種蛋白質(zhì)屬于整合膜、外周膜和可溶性蛋白質(zhì)。作者通過多元混合正態(tài)分布統(tǒng)計分析，從每個類別中挑選已知且經(jīng)過實驗驗證的參考蛋白質(zhì)進行驗證，數(shù)據(jù)集中的線粒體蛋白可分為完整的膜蛋白，可溶性蛋白以及界限模糊的四個蛋白組分（圖2a）。WB驗證結(jié)果表明該分離組分是可行的（圖2b），最后作者分別鑒定了321個完整的膜蛋白，258個完整的膜蛋白，226個可溶性蛋白和182個模糊蛋白（圖2d）。

圖1 線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)
 

圖2 線粒體蛋白定位

2. 鑒定新的線粒體蛋白質(zhì)

        數(shù)據(jù)集中發(fā)現(xiàn)鑒定到206個未被SGD數(shù)據(jù)庫和PROMITO數(shù)據(jù)庫注釋的蛋白。為了確定這些蛋白是否屬于新的線粒體蛋白或者是來自于未除干凈的其他細胞組分，作者比較了它們在線粒體和完整酵母細胞中的相對豐度（比值）（圖3a），結(jié)合WB實驗進行定位，發(fā)現(xiàn)比值分為三個區(qū)間，<1，1-10，>10。比值小于1則說明，蛋白全部定位在線粒體中，如Sod2、Mdh1和Tom22；比值在1-10之間表明蛋白在線粒體和細胞質(zhì)中均有分布，如S100和P100；比值大于10 的蛋白則有可能不定位在線粒體中，如Sod1（圖3b）。

了驗證比值大于10 這部分蛋白究竟是否會進入線粒體中，作者通過體外轉(zhuǎn)錄/翻譯合成了放射性標記的前體蛋白，并成功地將標記蛋白質(zhì)導(dǎo)入到分離線粒體中（圖3c）。作者檢測了14種不同的前蛋白，這些前蛋白迄今未注釋為線粒體蛋白，在數(shù)據(jù)集表現(xiàn)為可溶性或外周膜或模糊蛋白。根據(jù)膜電位Δψ結(jié)果顯示，所有前蛋白都被導(dǎo)入線粒體（圖3d-f），此外，部分蛋白質(zhì)在運輸進入線粒體后還進行了進一步蛋白剪切。總之，作者鑒定了迄今為止未劃分到線粒體的206種蛋白質(zhì)，并且證實了其中14種蛋白的線粒體定位。

圖3 驗證新蛋白質(zhì)的線粒體定位

3. 整合線粒體蛋白質(zhì)分布圖

        為了進一步完善線粒體蛋白質(zhì)分布全景圖，作者將上述鑒定的整合膜蛋白分別分配到外膜（OM）和內(nèi)膜（IM）。此外，作者作者使用公認的OM和膜間隙（IMS）參考蛋白質(zhì)組推導(dǎo)所有線粒體蛋白質(zhì)的亞定位。總而言之，酵母線粒體蛋白分布全景包括236個外周和245個整合的IM蛋白，21個外周和74個整合的OM蛋白，49個IMS和193個可溶性基質(zhì)蛋白（圖4）。

圖4 整合線粒體蛋白分布
 

文章小結(jié)

        作者首次將線粒體蛋白細分成外膜、膜間質(zhì)、內(nèi)膜和基質(zhì)四個不同組分，結(jié)合SILAC定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)將818種線粒體蛋白質(zhì)定位在對應(yīng)的亞區(qū)。此外本文不僅對蛋白在線粒體中的亞定位進行重新區(qū)分驗證，并且發(fā)現(xiàn)了206個新的線粒體蛋白，提供其在細胞器內(nèi)特定定位的詳細圖譜。

 

解析文獻

F.-Nora Vögtle, Julia M. Burkhart, et al. Landscape of submitochondrial protein distribution [J]. Nature Communications, 2017, 8:290. 

 

相關(guān)服務(wù)

        線粒體是真核細胞重要的細胞器，在細胞能量代謝、生物合成和細胞死亡中起關(guān)鍵性調(diào)控作用。系統(tǒng)地分析線粒蛋白質(zhì)的組成、表達水平以及修飾等狀態(tài)動態(tài)變化，旨在闡明線粒體內(nèi)全部蛋白質(zhì)的表達與存在方式、結(jié)構(gòu)與功能以及蛋白質(zhì)相互作用。對線粒體蛋白進行分離，通過LC-MS/MS進行鑒定和定量，深入理解細胞活動，對線粒體相關(guān)疾病的分子機制和以線粒體為靶標的藥物研究提供數(shù)據(jù)支撐。