Cancer Research！NFAT1- NDEL1軸將成為神經膠質瘤治療策略的重要目標
信息來源：金開瑞 作者：genecreate 發布時間：2019-05-27 09:50:08
題目：NFAT1-mediated regulation of NDEL1 promotes growth and invasion of glioma
stem-like cells
期刊：Cancer Research（IF=9.13）
合作技術：細胞系培養和鑒定
研究背景
神經膠質瘤是成人最常見、最難治療的原發性腦腫瘤，其腫瘤的發生發展與膠質瘤干細胞（GSCs）相關，因此針對這種細胞亞群的研究有利于膠質瘤的臨床治療。鑒于GSCs位于特殊的微環境中，且其誘導和維持機制在很大程度上仍然是未知的，所以揭示促使GSCs遷移侵襲和自我更新的分子機制對于GSCs定向治療的發展具有重要意義。在本篇文獻中，作者深入研究活化T細胞-1的鈣反應轉錄因子（NFAT1）在GSCs中的作用，并報告了一種新的GSCs維持途徑，即NFAT1- NDEL1軸（NDEL1是NFAT1下游靶點，神經發育蛋白1）將成為神經膠質瘤治療策略的重要目標。
研究內容及結果
1. 神經膠質瘤的臨床病理特征與NFAT1表達量有關
在前期膠質母細胞瘤中NFAT1系列研究基礎上，作者根據TCGA（癌癥和腫瘤基因圖譜）和Gravendeel（公開的臨床數據集）統計發現，神經膠質瘤的間充質亞型中NFAT1表達水平高于其他幾種亞型（圖1A），且NFAT1表達不僅與干細胞基因（CD44/Vimentin）和間質轉化相關基因（REL/LYN/TGFBR2）表達顯著相關，也與膠質瘤的預后較緩相關（圖1B-1C）。接下來，從新鮮的臨床多形性膠質母細胞瘤（GBM）等樣本中分離出GSCs，進行細胞系鑒定和富集培養，通過RT-qRCR和免疫熒光染色實驗發現，NFAT1高表達與膠質瘤的惡性亞型和GSCs的生長侵襲有關（圖1D-1E）。
圖1 NFAT1表達與神經膠質瘤的臨床病理特征的關系
2. NFAT1影響GSCs的生長和侵襲
為確定NFAT1對GSCs的生理影響，一方面，采用兩個獨立的shRNAs分別去轉導高表達NFAT1的LN229和G10 GSCs細胞。WB結果證實，其中一個NFAT1 shRNAs (shNFAT1-2) 轉導LN229和G10 GSCs后NFAT1減少了80%以上（圖2A）；體外細胞活性測定和流式分析顯示，NFAT1沉默顯著地降低GSCs的活性并誘導細胞凋亡（圖2B-2C）；此外，通過傷口愈合分析、Transwell分析和三維球體侵入分析得到，shNFAT1-2感染GSCs后細胞遷移和侵入行為顯著減少，且GSCs球體形成能力下降（圖2D-2G）。
另一方面，在基礎水平較低的T98G和G03 GSCs中實現NFAT1過表達（圖3A）。通過一系列細胞生物學檢測得到，NFAT1過表達顯著地增強細胞活性并抑制凋亡（圖3B-3C）、增加了GSCs的遷移和入侵（圖3D-3F）；同時電鏡圖顯示NFAT1刺激GSCs的神經球的形成過程（圖4G）。
圖2 NFAT1的沉默抑制GSCs的生長和侵襲
圖3 NFAT1的過表達促進GSCs的生長和侵襲
3. NFAT1對體內GSCs腫瘤生長具有重要意義
采用顱內小鼠模型，探究NFAT1沉默和過表達對體內GSCs腫瘤生長的影響。大腦切片染色結果顯示，與對照shRNA相比，NFAT1的敲除組顯著地抑制顱內腫瘤生長（圖4A-4B）；Kaplan–Meier生存曲線顯示T98G和G03 GSCs的細胞生存率增加，進而可推測出NFAT1 shRNAs（shNFAT1-1和shNFAT1-2）將更有效地延長小鼠生存期（圖4C-4F）。綜上所述，NFAT1在體外和體內都促進GSCs的腫瘤發生。
圖4 NFAT1表達影響體內GSCs的生長
4. NDEL1鑒定為NFAT1下游靶基因
通過開展轉錄組測序來確定NFAT1的潛在下游靶點，從熱圖數據中分別初篩出50個NFAT1沉默后下調基因和NFAT1過表達后上調的基因，上述均有可能是NFAT1介導的腫瘤促進基因（圖5A-5B）；結合TCGA和Gravendel數據集的生物信息學分析，發現NDEL1表達量在復發性GBMs中顯著地上調且涉及到間質過渡和干度增加的生理過程（圖5C-5D），同時也發現間充質GSCs細胞的NDEL1表達水平明顯高于原神經性GSCs細胞（圖5E-5F）。與此同時，在挖掘REMBRANDT補充數據集后發現，NDEL1表達不僅與GBMs低存活率相關，還參與膠質瘤的惡性進展。
圖5 神經膠質瘤表達與臨床病理特征的關聯
5. NDEL1由NFAT1轉錄調節并參與GSCs的發生發展
通過蛋白質印跡分析初步驗證轉錄組的數據，NFAT1的沉默顯著地降低了NDEL1的表達，且NFAT1的過表達顯著地增加了NDEL1的表達（圖6A-6B）；雙標記免疫熒光染色測定出在G10 GSC中NFAT1對NDEL1具有調節作用（圖6C-6D）；采用熒光素酶分析法檢測NAFT1對NDEL1啟動子活性的影響，結合ChIP-qPCR芯片分析得出NFAT與NDEL1啟動子結合（圖6E-6G）。鑒于NDEL1在GSCs生長和入侵中的作用機制尚未確定，由此使用兩個獨立的shRNAs來穩定地沉默G10 GSCs的NDEL1（圖6H）；陸續通過WB檢測、流式分析、基質凝膠分析、三維球體侵入分析得到，NDEL1的沉默顯著降低了G10 GSCs的侵入能力，且在很大程度上抑制了G10 GSCs的自我更新能力（圖6I-6M）。
圖6 NDEL1由NFAT1的轉錄調節
6. 在NFAT1沉默的GSCs中NDEL1重新表達可部分恢復腫瘤生長和侵襲
為了進一步研究NFAT1是否通過調節NDEL1表達來部分支持GSCs的攻擊行為，作者在FAT1沉默的G10 GSCs中建立NDEL1重新表達的體系（圖7A），發現NDEL1重新表達可部分恢復GSCs的生理活性，并減少了NFAT1沉默誘導的細胞凋亡（圖7B-7C）。根據基質凝膠分析、三維球體侵入分析和神經球形成檢測，得到NFAT1敲除后抑制的GSCs侵襲作用被NDEL1重新表達所挽救（圖7D-7E）并恢復了自我更新能力（圖7F-7G）；此外，大腦切片染色等體內驗證實驗表明，通過NDEL1重新表達僅部分非完全地緩解NFAT1基因敲除后體內腫瘤生長的抑制效應，也很可能涉及更多的未知途徑。
圖7 在NFAT1沉默的GSCs中NDEL1重新表達可恢復體外和體內的腫瘤生長
文章小結
本文旨在探討NFAT1在神經膠質瘤中的調節機制，通過基因敲除和過表達進行初步驗證，發現NFAT1表達與膠質瘤的侵襲性表型和生存率相關；RNA測序顯示NFAT1的缺失與NDEL1表達關聯；結合挽救實驗說明NFAT1調控了NDEL1的啟動子活性，NFAT1-NDEL1信號上調后激活ERK去提高GSCs干細胞標志物的蛋白水平和細胞分化水平。綜上所述，NFAT1通過調節NDEL1去部分控制GSCs的生長和侵襲，以NFAT1-NDEL1軸為靶點可為膠質瘤患者提供較大可能的治療機會。
解析文獻
Jiang Y, Song YF, Wang R, et al. NFAT1-mediated regulation of NDEL1 promotes growth and invasion of glioma stem-like cells. Cancer Res. 2019 Apr 2，DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-18-3297.
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