【客戶文獻(xiàn)分享】LINC01207和miR-143-5p的競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的自噬和凋亡

信息來(lái)源：金開(kāi)瑞作者：genecreate 發(fā)布時(shí)間：2019-05-30 16:21:52

題目：Long non-coding RNA LINC01207 silencing suppresses AGR2 expression to facilitate autophagy and apoptosis of pancreatic cancer cells by sponging miR-143-5p

期刊：Molecular and Cellular Endocrinology（IF=3.56）

合作技術(shù)： RNA pull down+RIP

研究背景

胰腺癌是一種嚴(yán)重的惡性腫瘤，伴隨著顯著地結(jié)締組織增生和間質(zhì)反應(yīng)，且5年內(nèi)相對(duì)生存率很低。盡管已發(fā)現(xiàn)炎癥過(guò)程是胰腺癌發(fā)展的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器，但由于缺乏篩查的成像方式和特定標(biāo)志物，導(dǎo)致早期胰腺癌較難被診斷；通常而言，手術(shù)是可切除胰腺癌中期最快速的治療方法，但患者由于藥性、轉(zhuǎn)移率高、預(yù)后不良和癌癥復(fù)發(fā)等因素，導(dǎo)致繼續(xù)面臨著不利結(jié)果。在本篇文獻(xiàn)中，重點(diǎn)探究長(zhǎng)鏈非編碼RNA（LINC01207）在胰腺癌細(xì)胞自噬和凋亡中的作用，及其與miR-143-5p相互作用的調(diào)節(jié)機(jī)制；并初步確定了lncRNA的表達(dá)譜和與胰腺癌相關(guān)的基因，為胰腺癌治療提供一個(gè)潛在靶點(diǎn)。

研究?jī)?nèi)容及結(jié)果

1. 在胰腺癌和癌旁組織中LINC01207、miR-143-5p和AGR2表達(dá)水平的變化

首先通過(guò)免疫組化檢測(cè)AGR2蛋白的表達(dá)情況，在光學(xué)顯微鏡下AGR2蛋白的陽(yáng)性表達(dá)顯示為棕黃色，且在癌組織中的蛋白陽(yáng)性率大于癌旁組織（圖1A-1C），可初步得到在胰腺癌中AGR2蛋白表達(dá)上調(diào)。

接著通過(guò)分析胰腺癌的基因綜合表達(dá)譜（GEO），其熱圖數(shù)據(jù)顯示出AGR2確實(shí)是顯著上調(diào)的基因（圖2A-2D）；進(jìn)一步分析微陣列GSE16515數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)LINC01207變化與AGR2呈正相關(guān)（圖2E-2F）；再通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)得到在胰腺癌中LINC01207和AGR2高表達(dá)、而miR-143-5p低表達(dá)（圖2G）。

圖1 胰腺癌組織中AGR2的陽(yáng)性表達(dá)上調(diào)

圖2 前列腺癌中circRNAs的表征和鑒定

2. 互作實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證出miR-143-5p可特異性與LINC01207和AGR2結(jié)合

調(diào)取出RNA22網(wǎng)站中LINC01207與miR-143-5p、miR-143-5p與AGR2的預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)信息（圖3A-3B）；構(gòu)建雙熒光素酶的報(bào)告基因，發(fā)現(xiàn)LINC01207-Wt與miR-143-5p mimic、AGR2-Wt與miR-143-5p mimic共處理時(shí)均顯著地降低了熒光素酶活性（圖3C-3D）；再通過(guò)RNA pull-down和RIP-qRCP正反驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得出LINC01207和miR-143-5p的結(jié)合關(guān)系以及miR-143-5p和AGR2的靶向關(guān)系。

圖3 miR-143-5p可特異性與LINC01207和AGR2結(jié)合

3. 初步探究LINC01207、miR-143-5p和AGR2的調(diào)控機(jī)制

通過(guò)RT-qPCR和WB檢測(cè)了在五個(gè)細(xì)胞株中AGR2的表達(dá)情況，篩選出最佳的Mpanc-96細(xì)胞株供進(jìn)一步應(yīng)用（圖4A-4C）。接下來(lái)，采用RT-qPCR分析Mpanc-96細(xì)胞株中LINC01207、miR-143-5p和AGR2的表達(dá)模式，得到沉默LINC01207可以降低LINC01207與miR-143-5p結(jié)合情況，進(jìn)而導(dǎo)致mir-143-5p高表達(dá)和AGR2低表達(dá)（圖4D）。

圖4 選擇Mpanc-96細(xì)胞株來(lái)探究LINC01207、miR-143-5p和AGR2的調(diào)控機(jī)制

4. 深度探究LINC01207、miR-143-5p和AGR2的調(diào)控機(jī)制

一方面，采用免疫熒光染色檢測(cè)LC3II的表達(dá)情況，得到siRNA-LINC01207和miR-143-5p mimic治療后LC3II蛋白表達(dá)升高、DyLin 488染色結(jié)果呈點(diǎn)狀的綠色熒光，而miR-143-5p inhobitor治療后LC3II蛋白表達(dá)降低（圖5A）；同時(shí)發(fā)現(xiàn)siRNA-LINC01207 + miR-143-5p mimic共轉(zhuǎn)染后具有更高的LC3II表達(dá)量（圖5B）。

另一方面，采用免疫印跡法檢測(cè)自噬和凋亡相關(guān)蛋白（LC3II、P62、beclin-1、Bcl-2、Bax、AGR2，內(nèi)參GAPDH），同上組別間的趨勢(shì)比較，得出沉默LINC01207和過(guò)表達(dá)miR-143-5p可增加LC3II、beclin-1蛋白表達(dá)，同時(shí)降低P62、AGR2蛋白表達(dá)和Bcl-2/Bax蛋白比率，從而誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞自噬和凋亡（圖6A-6B）。

圖5 抑制LINC01207和升高miR-143-5p可促進(jìn)胰腺癌中LC3II的表達(dá)

圖6 抑制LINC01207和升高miR-143-5p可促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞凋亡和自噬

5. 細(xì)胞功能學(xué)驗(yàn)證了抑制LINC01207和升高miR-143-5p對(duì)胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

首先采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，生長(zhǎng)曲線顯示siRNA-LINC01207 + miR-143-5p mimic聯(lián)合治療對(duì)胰腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)有較強(qiáng)的抑制作用（圖7A）。其次采用TUNEL染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，在高倍鏡下選擇200個(gè)細(xì)胞計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞的百分比，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示80nM siRNA-LINC01207單獨(dú)或與miR-143-5p mimic聯(lián)合治療能顯著地促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞凋亡（圖7B-7C）；同時(shí)采取流式細(xì)胞術(shù)也得到了一致的結(jié)果（圖7D）。最后采用吖啶橙染色來(lái)計(jì)算酸性自噬囊泡細(xì)胞的比例，通過(guò)在熒光顯微鏡下觀察和統(tǒng)計(jì)，得到siRNA-LINC01207 + miR-143-5p mimic聯(lián)合治療可促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞自噬（圖7E-7F）。總的來(lái)說(shuō)，抑制LINC01207和升高miR-143-5p能促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的凋亡并引起自噬效應(yīng)。

圖7 細(xì)胞功能學(xué)驗(yàn)證LINC01207和miR-143-5p對(duì)胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

文章小結(jié)

本文旨在探究LINC01207在腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡和侵襲中作用機(jī)制，通過(guò)胰腺癌的基因綜合表達(dá)譜（GEO）篩選出顯著上調(diào)的基因AGR2；再根據(jù)GSE16515數(shù)據(jù)集和分子驗(yàn)證得到LINC01207變化與AGR2呈正相關(guān)；然后測(cè)定胰腺癌和癌旁組織中AGR2、LINC01207和miR-143-5p的表達(dá)模式，并驗(yàn)證出LINC01207和miR-143-5p的結(jié)合關(guān)系以及AGR2和miR-143-5p的靶向關(guān)系；最后通過(guò)自噬和凋亡相關(guān)的細(xì)胞功能指標(biāo)進(jìn)一步確認(rèn)機(jī)制。綜上所述，本研究提供了一個(gè)新的視角，沉默LINC01207即可通過(guò)削弱以miR-143-5p為靶向的AGR2表達(dá)來(lái)抑制胰腺癌的進(jìn)展，為臨床治療提供一個(gè)新的視角。

解析文獻(xiàn)

Liu C, Wang JO, Zhou WY, et al. Long non-coding RNA LINC01207 silencing suppresses AGR2 expression to facilitate autophagy and apoptosis of pancreatic cancer cells by sponging miR-143-5p. Mol Cell Endocrinol. 2019 Apr 13. DOI: 10.1016/j.mce.2019.04.004.

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