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專題講座|經(jīng)典互作，大有作為

信息來源：金開瑞作者：genecreate 發(fā)布時間：2020-06-01 16:41:26

分子互作是生命體的普遍主題，分子互作技術(shù)是生命科學(xué)的基礎(chǔ)技術(shù)。分子互作包含核酸與核酸互作、核酸與蛋白互作、蛋白與蛋白互作這三種類型。隨著人類基因組計劃的完成，后基因組時代的深入，測序、質(zhì)譜、生物信息聯(lián)合分析等技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，使得高通量篩選生物標(biāo)記物、尋找生物關(guān)聯(lián)分子變得可能，同時對分子互作技術(shù)的應(yīng)用提出了更高的要求。

金開瑞多年來致力于分子互作機(jī)制研究，組建了專門分子互作研究技術(shù)團(tuán)隊(duì)，擁有豐富的互作類項(xiàng)目設(shè)計、實(shí)施經(jīng)驗(yàn)，可以為您提供核酸與核酸、核酸與蛋白、蛋白與蛋白間等各類從方案流程設(shè)計到技術(shù)實(shí)施的整套互作研究服務(wù)。

本文將詳細(xì)闡述這三種互作類型的原理及技術(shù)流程，讓大家更好的理解吸收，助您科研成功，早日發(fā)文！

1、核酸與核酸互作

miRNA可以與mRNA結(jié)合調(diào)節(jié)體內(nèi)基因的表達(dá)，通過影響蛋白的表達(dá)、修飾、酶活性等來調(diào)節(jié)生命活動的進(jìn)行。lncRNA作為體內(nèi)的ceRNA，可以與miRNA結(jié)合起到調(diào)節(jié)基因表達(dá)的作用。研究lncRNA與miRNA的相互作用對于研究生命具有重要的意義。通過MS2-RIP和靈敏度更高的雙螢光素酶技術(shù)，來研究lncRNA和miRNA的相互作用。

1. 1 MS2-RIP

MS2-RIP技術(shù)主要是應(yīng)用針對GFP抗體的Protein G磁珠把相應(yīng)的RNA-蛋白復(fù)合物沉淀下來，然后經(jīng)過分離純化就可以對結(jié)合在復(fù)合物上的RNA 進(jìn)行q-PCR驗(yàn)證或者測序分析。

技術(shù)流程

1.2 雙螢光素酶報告系統(tǒng)

雙螢光素酶報告基因通常將一個報告基因作為內(nèi)對照，使另一個報告基因的檢測均一化。檢測基因表達(dá)時雙報告基因通常用來瞬時轉(zhuǎn)染培養(yǎng)細(xì)胞，帶有實(shí)驗(yàn)報告基因的載體和帶有不同報告基因的第二個載體共轉(zhuǎn)染培養(yǎng)細(xì)胞。通常實(shí)驗(yàn)報告基因偶聯(lián)到調(diào)控的啟動子，研究調(diào)控基因的結(jié)構(gòu)和生理基礎(chǔ)。報告基因表達(dá)活力的相對改變與偶聯(lián)調(diào)控啟動子轉(zhuǎn)錄活力的改變相關(guān)，偶聯(lián)到組成型啟動子的第二個報告基因，提供轉(zhuǎn)錄活力的內(nèi)對照，使測試不被實(shí)驗(yàn)條件變化所干擾。

金開瑞應(yīng)用Promega 公司的雙螢光素酶報告基因檢測(DLR)系統(tǒng)，提供DLR 檢測服務(wù)。

技術(shù)流程

了解更多：答疑|雙熒光素酶報告基因服務(wù)咨詢匯總

2、核酸-蛋白互作

蛋白與核酸的相互作用廣泛存在于生命活動的調(diào)節(jié)中。基因的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯、修飾等過程都離不開核酸和蛋白的互作。金開瑞提供RNA pull down+質(zhì)譜、染色質(zhì)免疫共沉淀、凝膠遷移或電泳遷移率檢測（EMSA）、酵母單雜交、DNA pull down等技術(shù)來檢測DNA/RNA與蛋白的相互作用。

2.1 RNA pull down

蛋白質(zhì)與RNA 的相互作用是許多細(xì)胞功能的核心，如蛋白質(zhì)合成、mRNA 組裝、病毒復(fù)制、細(xì)胞發(fā)育調(diào)控等。使用體外轉(zhuǎn)錄法標(biāo)記生物素RNA 探針，然后與胞漿蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。該復(fù)合物可與鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠結(jié)合，從而與孵育液中的其他成分分離。復(fù)合物洗脫后，通過WB 實(shí)驗(yàn)檢測特定的RNA 結(jié)合蛋白是否與RNA 相互作用。若待檢測目的蛋白明確，選擇WB鑒定；若不明確，則可選擇質(zhì)譜鑒定。

金開瑞現(xiàn)提供RNA pull down 檢測技術(shù)服務(wù), 使用特異性二抗進(jìn)行檢測，能有效避免抗體重鏈對結(jié)果的信號干擾。并且金開瑞配套自己的質(zhì)譜平臺，能顯著提升檢測效果。

技術(shù)流程

了解更多：科研集市-4丨看！RNA pull down——研究RNA與蛋白互作的法寶

2.2 DNA Pull down

DNA pull down是用于分析蛋白質(zhì)與DNA互作的一種分析技術(shù)。一般來說，該實(shí)驗(yàn)首先需要針對待研究目的基因的調(diào)控區(qū)域設(shè)計并制備特異性探針（以脫硫生物素標(biāo)記為主流）；同時，制備細(xì)胞核提取物；將探針和核提取物共同孵育，DNA結(jié)合蛋白就會和靶向序列特異性結(jié)合；然后，通過親和素磁珠純化蛋白質(zhì)DNA復(fù)合物；最后針對獲得的蛋白，使用WB驗(yàn)證或者質(zhì)譜方式鑒定蛋白質(zhì)類型。

技術(shù)流程

2.3 RNA 結(jié)合蛋白免疫沉淀（RIP）

RIP 技術(shù)（RNA Binding Protein Immunoprecipitation Assay，RNA 結(jié)合蛋白免疫沉淀）主要是運(yùn)用針對目標(biāo)蛋白的抗體把相應(yīng)的RNA-蛋白復(fù)合物沉淀下來，然后經(jīng)過分離純化就可以對結(jié)合在復(fù)合物上的RNA 進(jìn)行q-PCR驗(yàn)證或者測序分析。RIP 是研究細(xì)胞內(nèi)RNA 與蛋白結(jié)合情況的技術(shù)，是了解轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)動態(tài)過程的有力工具，可以幫助我們發(fā)現(xiàn)miRNA 的調(diào)節(jié)靶點(diǎn)。

根據(jù)客戶需求，金開瑞可以提供RNA/蛋白、RNA/RNA互作驗(yàn)證RIP技術(shù)服務(wù)。

技術(shù)流程

2.4 染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（ChIP）

ChIP染色體免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是基于體內(nèi)分析發(fā)展起來的方法，也稱結(jié)合位點(diǎn)分析法，在過去十年已經(jīng)成為表觀遺傳信息研究的主要方法。這項(xiàng)技術(shù)幫助研究者判斷在細(xì)胞核中基因組的某一特定位置會出現(xiàn)何種組蛋白修飾。ChIP不僅可以檢測體內(nèi)反式因子與DNA的動態(tài)作用，還可以用來研究組蛋白的各種共價修飾與基因表達(dá)的關(guān)系。近年來，這種技術(shù)得到不斷的發(fā)展和完善。采用結(jié)合微陣列技術(shù)在染色體基因表達(dá)調(diào)控區(qū)域檢查染色體活性，是深入分析癌癥、心血管疾病以及中央神經(jīng)系統(tǒng)紊亂等疾病的主要通路的一種非常有效的工具。

技術(shù)流程

了解更多：科研集市-9丨關(guān)于ChIP那點(diǎn)事兒，可以說是很實(shí)用了！

2.5 凝膠遷移或電泳遷移率檢測（EMSA）

凝膠遷移或電泳遷移率檢測（Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA）是一種檢測蛋白質(zhì)和DNA序列相互結(jié)合的技術(shù)，可用于定性和定量分析；目前已用于研究RNA結(jié)合蛋白和特定的RNA序列的相互作用，是轉(zhuǎn)錄因子研究的經(jīng)典方法。

金開瑞提供EMSA檢測技術(shù)服務(wù)，幫助您檢測DNA結(jié)合蛋白、RNA結(jié)合蛋白、特定的蛋白質(zhì)，并可進(jìn)行未知蛋白的鑒定。

詳情點(diǎn)擊：老師，這是我的滿分實(shí)驗(yàn)報告！

2.6 酵母單雜交（Y1H）

將提取的樣品RNA 逆轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA,經(jīng)長距離聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增得到雙鏈cDNA，再經(jīng)CHROMA SPIN TE-400 柱子純化后與酵母表達(dá)載體pGADT7-Rec 線性質(zhì)粒共轉(zhuǎn)至Y1HGold[pBait-AbAi]酵母感受態(tài)，經(jīng)SD/-Leu/AbA 缺陷培養(yǎng)基篩選出與誘餌序列相互作用的獵物蛋白。

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3、蛋白-蛋白互作

蛋白是生命活動的執(zhí)行者，可以以單一分子或者復(fù)合體形式執(zhí)行生命活動。蛋白分子間相互作用是蛋白分子組建復(fù)合體、執(zhí)行功能的一個途徑。金開瑞可以提供免疫共沉淀、GST pull down、酵母雙雜交技術(shù)檢測蛋白分子間的相互作用。其中，免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有更接近真實(shí)生理?xiàng)l件下蛋白相互作用信息的優(yōu)點(diǎn)，配合GST pull down，可以研究蛋白之間是直接相互作用還是間接相互作用，而酵母雙雜對于研究低表達(dá)的蛋白、瞬時表達(dá)蛋白具有更高靈敏度的優(yōu)點(diǎn)。

3.1 免疫共沉淀 (Co-IP）

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）是將樣品中同抗體靶蛋白相互作用的蛋白一同隨免疫復(fù)合物沉淀，然后進(jìn)行檢測的技術(shù)。通過免疫共沉淀可以檢測兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)存在相互作用（直接或者間接），免疫共沉淀后通過質(zhì)譜技術(shù)也可以尋找一種蛋白在體內(nèi)的相互作用蛋白。

金開瑞現(xiàn)提供IP 和Co-IP 檢測技術(shù)服務(wù), 使用特異性二抗進(jìn)行檢測，能有效避免抗體重鏈對結(jié)果的信號干擾，顯著提升檢測效果。同時，如果想尋找與目的蛋白結(jié)合的未知互作蛋白，通過質(zhì)譜平臺，金開瑞可以為您提供互作蛋白尋找鑒定服務(wù)。

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了解更多：科研集市-8丨利用CoIP-MS高效篩選體內(nèi)互作蛋白

3.2 GST融合蛋白沉降（GST pull down）

蛋白質(zhì)相互作用的類型有牢固型相互作用和暫時型相互作用兩種。牢固型相互作用以多亞基蛋白復(fù)合體常見，最好通過免疫共沉淀(Co-IP)或Pull down技術(shù)研究。Pull down技術(shù)用固相化的、已標(biāo)記的餌蛋白或標(biāo)簽蛋白(生物素-、PolyHis-或GST-)，從細(xì)胞裂解液中釣出與之相互作用的蛋白。

通過Pull down技術(shù)可以確定已知的蛋白與釣出蛋白或已純化的相關(guān)蛋白間的相互作用關(guān)系，從體外傳路或翻譯體系中檢測出蛋白相互作用關(guān)系。同時，如果您不清楚具體的互作蛋白，想尋找與目的蛋白結(jié)合的互作蛋白，通過質(zhì)譜平臺，金開瑞可以為您提供互作蛋白尋找鑒定服務(wù)。

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3.3 酵母雙雜交（Y2H）

酵母雙雜交技術(shù)最初由Fields等人在研究酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4性質(zhì)時建立，后續(xù)經(jīng)過不斷改進(jìn)已發(fā)展成為一種成熟的蛋白-蛋白互作研究工具，具有簡便、靈敏、可反映蛋白在活細(xì)胞內(nèi)互作真實(shí)情況的特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于互作蛋白的篩選、蛋白相互作用的鑒定/驗(yàn)證、蛋白互作機(jī)理的探究、蛋白連鎖圖譜繪制等工作。

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