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老師，這是我的滿分實驗報告！

信息來源：金開瑞作者：genecreate 發布時間：2020-06-01 16:58:33

一、實驗原理

凝膠遷移或電泳遷移率實驗 (electrophoretic mobility shift assay，EMSA)是一種研究DNA結合蛋白和其相關的DNA結合序列相互作用的技術，可用于定性和定量分析(Hellman LM and Fried MG, 2007)。這一技術最初用于研究DNA結合蛋白，目前也可用于研究RNA結合蛋白和特定的RNA序列的相互作用 (Rio, 2018)。

在實驗中，通常將純化的蛋白或細胞粗提液和生物素標記的DNA或RNA探針一同保溫，在非變性的聚丙烯凝膠電泳上，分離復合物和非結合的探針。其中DNA-復合物或RNA-復合物比非結合的探針移動得慢，而探針移動的較快。

圖1 EMSA原理圖

二、實驗目的

對探針和蛋白進行互做驗證

三、主要儀器

DYCP-32A核酸電泳儀

GNP-9080型恒溫培養箱

GL-21M型高速冷凍離心機

DK-42恒溫水浴鍋

Forma3111型細胞培養箱

JY92-IIN型細胞超聲破碎儀

ZQWY-200型恒溫振蕩器

四、實驗步驟

樣本制備

探針標記及檢測

形成蛋白-探針復合物

制備凝膠、電泳

轉膜

檢測

五、課后習題及解答

1.研究蛋白-核酸互作有哪些技術？

答：凝膠電泳遷移率（EMSA）、染色質免疫沉淀（ChIP）、RNA Pull Down / DNA Pull Down、雙熒光素酶報告基因、酵母單雜交。

2、為什么實驗背景高？

答：1）TBE溶液中有懸浮物；2）曝光或者成像時間過長；3）蛋白的質量不高，雜質多；4）沒有清洗干凈；5）實驗過程中膜沒有一直處于濕潤狀態；6）封閉時間不足或者效率不高。

3、探針的存儲條件？

答：為防止探針降解，探針應保存在 -20 ℃。

4、為什么看不到遷移帶？

答：1）蛋白降解或者提取量不足；2）標記的DNA探針量太少或者樣本中沒有可以與探針結合的蛋白；3）探針降解或者探針與蛋白無特異性互作；4）曝光或成像時間過短；5）轉膜效率低或者未轉過來。

5. Western Blot和EMSA有什么不同的意義

答：Western Blot 只能反應含量，不能反應待測分子的生物學活性。EMSA是蛋白分子與靶序列核酸的結合量，反應的是該分子的生物學活性。

6.在DNA探針的選擇上，要考慮哪些重要因素？

答：1）目的DNA的長度應小于300bp；2）如目的蛋白已被鑒定，應該使用短的寡核苷酸片段；3）長的限制性酶切片段可用于對特定的啟動子/增強子區域內的蛋白結合位點定位。

六、考試重點

1.金開瑞EMSA技術金開瑞EMSA技術

金開瑞提供EMSA檢測技術服務，幫助您檢測DNA結合蛋白、RNA結合蛋白、特定的蛋白質，并可進行未知蛋白的鑒定。

2技術流程技術流程

接收訂單及樣品、實驗設計、合成探針、EMSA電泳凝膠配置、EMSA反應、電泳檢測、顯色反應、結果交付

3客戶提供

1）.需提取核蛋白的細胞＞107，動物組織不少于400 mg，植物組織不少于2 g，建議客戶在金開瑞表達重組蛋白；

2.）探針序列；如使用結合蛋白特異性抗體，抗體50 μL以上，濃度大于0.5 mg/mL。

4 最終交付

實驗報告，含完整的實驗流程、實驗結果數據及圖片。

七、課外延伸

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八、參考文獻

Hellman LM and Fried MG, 2007. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature protocols, 2(8):1849-61.

Rio DC, 2018. Electrophoretic mobility shift assays for RNA-protein complexes.Cold Spring Harb Protoc, (4):435-40.

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